Summary
DDS-AGE est une technique utile pour la détection et la caractérisation de l'amyloïde comme les polymères dans les cellules. Ici nous démontrons une adaptation qui rend cette technique prêtent à grande échelle des applications.
Abstract
L'agrégation amyloïde est associée à de nombreuses pathologies mauvais repliement des protéines et des sous-tend les propriétés infectieuses des prions, qui sont auto-conformation des protéines templating qui sont pensés pour avoir des rôles bénéfiques dans les organismes inférieurs. Amyloïdes ont été notoirement difficile à étudier en raison de leur insolubilité et de l'hétérogénéité structurelle. Cependant, la résolution de polymères amyloïde basée sur la taille et de l'insolubilité de détergent a été rendue possible par semi-dénaturantes Détergent-électrophorèse sur gel (SDD-âge). Cette technique est de trouver l'utilisation généralisée pour la détection et la caractérisation des variantes amyloïdes conformation. Ici, nous démontrons une adaptation de cette technique qui facilite son utilisation dans les applications à grande échelle, tels que des écrans pour les prions roman et d'autres protéines amyloïdogénique. La nouvelle SDD-ÂGE méthode utilise le transfert capillaire pour une plus grande fiabilité et facilité d'utilisation, et permet à tout gel de taille à être logé. Ainsi, un grand nombre d'échantillons, préparés à partir de cellules ou de protéines purifiées, peuvent être traitées simultanément la présence de SDS-insolubles de protéines conformères marqués.
Protocol
Partie 1: Préparer le gel
- Montez le plateau de coulée de gel. L'équipement standard pour l'électrophorèse l'ADN horizontale peut être utilisé. Pour un grand nombre d'échantillons, nous préparons un 20 cm x 24 cm dalle avec un maximum de quatre 50-bien peignes. Assurez-vous que la dalle n'a pas les égratignures, car ils peuvent déformer l'image blot.
- Créer une solution de 1,5% d'agarose (moyen ou élevé de gel solidité, faible OEE) de TAE 1X. Le volume devrait être suffisant pour submerger entièrement les dents du peigne - vous voulez charger l'échantillon autant que possible pour maximiser la détection. Micro-ondes le mélange jusqu'à l'agarose est complètement dissous.
- Ajouter rapidement SDS à 0,1% à partir d'un stock de 10%. Faire tourbillonner pour mélanger. Si certains d'agarose se solidifie au cours de cette étape, redissolvent utilisant une plaque chauffante et être prudent pour éviter l'ébullition.
- Verser la solution dans le bac prépondérante. Utilisez un peigne à ratisser les bulles, car ils pourraient interférer avec le transfert tard.
- Après un gel a pris, retirer peignes et placer le gel dans le réservoir de gel. Immerger complètement le gel dans 1X TAE contenant 0,1% SDS.
Partie 2: Préparation des échantillons
- Pour analyse à haut débit des lysats levure, nous commençons avec 2 ml cultures cultivées pendant une nuit sous agitation rapide de 96 puits blocs. Dans ce cas, chaque culture est surexprimant une protéine d'intérêt. Lors de l'analyse des protéines de faible abondance, les volumes de culture plus large doit être utilisé
- Récolte des cellules par centrifugation à 2000 RCF pendant 5 min à température ambiante.
- Resuspendre les cellules dans l'eau et centrifuger à nouveau.
- Remettre en suspension dans 1 ml de solution sphéroplastes. Incuber pendant environ 30 min à 30 ° C (vous pouvez confirmer l'efficacité sphéroplastes par microscopie).
- Centrifuger à 800 RCF pendant 5 min à température ambiante. Supprimer complètement le surnageant.
- Resuspendre sphéroplastes granulés dans 100 ml de tampon de lyse.
- Couvrir le bloc avec du ruban adhésif et le vortex à haute vitesse pendant 2 min.
- Culot cellulaire débris à 4000 RCF pendant 2 min.
- Retirer délicatement le surnageant dans un nouveau conteneur, par exemple, une plaque de 96 puits PCR.
- Si désiré, déterminer la concentration en protéines des lysats.
- Ajouter le tampon d'échantillon 4X pour les échantillons contenant de générer lysats 1X tampon de l'échantillon. Incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Charge de gel. Si désiré, économiser la moitié du volume d'échantillon et de la faire bouillir pour analyse SDS-PAGE. Afin de surveiller l'ampleur du transfert par la suite, notamment un pré-SDS-PAGE coloré marqueur. De plus, un marqueur de poids moléculaire composé de protéines très élevé (par exemple, le poulet pectoral extrait) peut être utilisé pour estimer la taille des complexes résolus.
- Exécutez à basse tension (≤ 3 la longueur du gel V / cm) jusqu'à ce que le front atteigne ~ 1 cm de l'extrémité du gel. Cela va prendre plusieurs heures. Il est important que le gel rester cool, sinon la diffusion de protéines de faible poids moléculaire (par exemple, les monomères) peut limiter leur détection.
Partie 3: Transfert
- Coupez un morceau de nitrocellulose aux mêmes dimensions que le gel.
- Coupez 20 morceaux de GB004 et GB002 8 morceaux de papier buvard, pour les mêmes dimensions que le gel. Couper une pièce supplémentaire de GB004 pour être utilisé comme une mèche, il font environ 20 centimètres plus large que le gel.
- Plonger la nitrocellulose, mèche, et 4 morceaux de GB002 en 1X SCT.
- Dans un récipient en plastique, d'assembler une pile de papiers comme suit: 20 morceaux de GB004 sécher, puis 4 morceaux de GB002 sec, puis un morceau de pré-humide GB002. Poser la nitrocellulose en haut de cette pile.
- Rincer le gel sur le plateau de coulée brièvement dans l'eau pour enlever l'excès tampon. Puis, soigneusement commencer à glisser le gel hors du bac sur la pile. Tout en faisant glisser le gel hors du bac, éteindre la membrane avec le SCT, si nécessaire. Le tampon supplémentaire permet d'éviter les bulles de devenir coincé sous le gel. Une pipette de transfert fonctionne bien dans ce but.
- Après le gel a été déplacé à la pile, vérifiez soigneusement pour les bulles. Si elles existent, soulevez le bord du gel et de réappliquer tampon jusqu'à ce que les bulles peuvent être élaborées.
- Mettez les trois autres pré-mouillé GB002 morceaux sur le dessus du gel. Assurer un contact complet entre toutes les couches de roulement par une pipette fermement sur le haut de la pile.
- Flanc la pile de transfert avec deux plateaux élevés contenant du SCT. Drapé de la mèche pré-humide dans la pile de sorte que chaque extrémité de la mèche est immergé dans le SCT.
- Couvrir la pile transfert assemblé avec un plateau en plastique supplémentaires portant le poids supplémentaire (par exemple, une bouteille de 500 ml d'eau).
- Autoriser le transfert de procéder à un minimum de trois heures, ou jusqu'au lendemain.
- Après le transfert, la membrane peut être traitée par la norme Western blot.
Solution sphéroplastes
1,2 M de D-sorbitol
0,5 mM MgCl 2
Tris 20 mM, pH 7,5
50 mM BME (ajouter frais)
0,5 mg / ml Zymolyase 100T (ajouter frais)
coration: underline; "Lysis Buffer>
100 mM de Tris 7,5
NaCl 50 mM
BME 10 mM (ajouter frais)
inhibiteurs de protéase (ajouter frais)
Tampon d'échantillon 4X
2X TAE
20% de glycérol
8% de SDS
bleu de bromophénol à la préférence
Discussion
SDD-AGE a été d'abord rapporté par Kryndushkin et al. 1, pour étudier SDS-résistants complexes de la [PSI +] prion chez la levure, et a depuis trouvé une utilisation largement répandue étudier à la fois à prions et les non-prion agrégats 2-9. Toutefois, le transfert des protéines à une électrophorèse membrane suite à un gel d'agarose est problématique, et peut aboutir à une image déformée blot 5. De plus, la technique submergée électrotransfert les plus couramment utilisés introduit des limitations pratiques à la taille du gel et donc le nombre d'échantillons qui peuvent être traitées. Nous avons résolu ces problèmes en employant la baisse transfert capillaire 10, une procédure simple qui utilise une pile de sèche buvards de transférer les protéines du gel sur une membrane de nitrocellulose. Transfert capillaire évite la déformation et permet des gels importants pour être traités facilement. Il ya quelques choses à considérer avant d'utiliser DDS-AGE. Pour les échantillons bruts (par exemple, des lysats), immunodétection des protéines spécifiques est nécessaire. SDD-âge n'a pas totalement dénaturer les complexes protéines d'intérêt, alors la protéine (s) à détecter doit porter une étiquette épitopique en dehors de la région amyloïdogénique. Lysats peuvent généralement être préparés comme ils le seraient pour une normale de SDS-PAGE, avec deux différences importantes. Premièrement, les soins accrue doivent être prises pour prévenir la dégradation par protéolyse. Les conditions partiellement dénaturantes utilisées ici ne sont pas suffisantes pour inactiver les protéases, et peut également fabriquer des protéines cibles plus sensibles à la protéolyse. Utilisez un cocktail inhibiteur de la protéase complète au moins deux fois la concentration recommandée. Deuxièmement, le chauffage des échantillons devrait être évitée. Si un contrôle tous les monomères négatif est souhaitée, par exemple pour confirmer que haut poids moléculaire des espèces ne sont pas dues à des modifications covalentes, une incubation de 10 minutes à 95 ° C peut être utilisé, ce qui va restaurer la plupart amyloïdes à la protéine monomérique.
Acknowledgments
Nous remercions Simon Alberti pour l'assistance à l'élaboration de ce protocole. Ce travail a été soutenu par une subvention des National Institutes of Health (GM25874), du Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (pour SL), et un National Science Foundation bourse de formation pré-doctorale (pour HR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zymolyase 100T | Seikagaku Corporation | 120493-1 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78429 | |
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | |
| GB004 blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 10427926 | |
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-917 | |
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
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