Summary
SDD-AGE ist eine nützliche Technik für die Erkennung und Charakterisierung von Amyloid-ähnlichen Polymeren in den Zellen. Hier zeigen wir eine Anpassung, dass diese Technik zugänglich großflächige Anwendungen macht.
Abstract
Amyloid-Aggregation ist mit zahlreichen Proteinfehlfaltung Pathologien und unterliegt der infektiösen Eigenschaften von Prionen, die konformativ sind selbsterklärend Templating Proteine, die vermutlich von Vorteil Rollen in niederen Organismen haben. Assoziiert Amyloide sind notorisch schwierig zu studieren aufgrund ihrer Unlöslichkeit und strukturelle Heterogenität. Allerdings hat eine Auflösung von Amyloid-Polymere auf Basis von Größe und Reinigungsmittel Unlöslichkeit Basis wurde möglich durch Semi-denaturierenden Detergens-Agarose-Gel-Elektrophorese (SDD-AGE). Diese Technik ist zu finden breite Anwendung für den Nachweis und die Charakterisierung von Amyloid-Konformations-Varianten. Hier zeigen wir, eine Anpassung dieser Technik, dass seine Verwendung erleichtert in großen Anwendungen, wie zum Beispiel Bildschirme für neuartige Prionen und anderen amyloidogenen Proteinen. Das neue SEPA-AGE-Methode verwendet Kapillartransfer für höchste Zuverlässigkeit und Benutzerfreundlichkeit und ermöglicht Unternehmen jeder Größe Gel untergebracht werden. So kann eine große Anzahl von Proben, die aus Zellen oder gereinigte Proteine hergestellt, gleichzeitig auf das Vorhandensein von SDS-unlöslichen Konformere markierte Proteine weiterverarbeitet werden.
Protocol
Teil 1: Vorbereiten des Gels
- Montieren Sie den Gelträger. Serienausstattung für horizontale DNA-Elektrophorese verwendet werden kann. Für eine große Anzahl von Proben, bereiten wir eine 20 cm x 24 cm Platte mit bis zu vier 50-gut Kämme. Sicherstellen, dass die Platte nicht Kratzer, da diese die blot Bild verzerren können.
- Erstellen Sie ein 1,5% Agarose-Lösung (mittlere oder hohe Gel-Festigkeit, geringes EBO) in 1X TAE. Das Volumen sollte ausreichen, um komplett versenken die Kammzähne - Sie wollen so viel wie möglich zu laden Probe den Nachweis zu maximieren. Microwave die Mischung, bis die Agarose vollständig gelöst ist.
- Schnell add SDS zu 0,1% aus einer 10% Aktien. Swirl zu mischen. Wenn einige Agarose erstarrt bei diesem Schritt wieder auflösen mit einer heißen Platte und vorsichtig sein, um zu vermeiden Kochen.
- Füllen Sie die Lösung in die Casting-Fach. Verwenden Sie einen Kamm zu harken jegliche Blasen, wie sie später mit Transfer stören könnten.
- Nach gel gesetzt hat, entfernen Sie Kämme und Stelle das Gel in das Gel Tank. Ganz untertauchen das Gel in 1X TAE mit 0,1% SDS.
Teil 2: Probenvorbereitung
- Für Hochdurchsatz-Analyse von Hefe-Lysaten, beginnen wir mit 2-ml-Kulturen über Nacht unter schnellem Rühren in 96-Well-Blocks gewachsen. In diesem Fall wird jede Kultur Überexpression eines Proteins von Interesse. Bei der Analyse geringer Menge Proteine, müssen größere Kultur-Volumes verwendet werden
- Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 2000 RCF für 5 min bei Raumtemperatur.
- Die Zellen in Wasser und Zentrifuge wieder.
- Resuspendieren in 1 ml Spheroplasting Lösung. Inkubieren für ca. 30 min bei 30 ° C (Sie können Spheroplasting Effizienz durch Mikroskopie bestätigt).
- Zentrifuge bei 800 RCF für 5 min bei Raumtemperatur. Vollständig zu entfernen Überstand.
- Resuspendieren pelletiert Sphäroplasten in 100 ml Lysepuffer.
- Bedecken Sie den Block mit Klebeband und Wirbel bei hoher Geschwindigkeit für 2 min.
- Pellet Zelltrümmer bei 4000 RCF für 2 min.
- Sorgfältig Überstand zu entfernen, um einen neuen Container, z. B. eine 96-well PCR-Platte.
- Wenn gewünscht, Bestimmung der Proteinkonzentration der Lysate.
- Add 4X Probenpuffer, um die Proben zu Lysaten mit 1x Probenpuffer zu generieren. Inkubieren für 5 min bei Raumtemperatur.
- Last-Gel. Falls gewünscht, speichern Sie die Hälfte des Probenvolumens und kochen sie für die SDS-PAGE-Analyse. Um das Ausmaß der Übertragung später auf dem Monitor, eine pre-gefärbten SDS-PAGE-Marker. Darüber hinaus kann ein Molekulargewichtsmarker, bestehend aus sehr großen Proteine (zB Huhn pectoralis-Extrakt) verwendet, um Größen von der beschlossenen Komplexe zu schätzen.
- Run bei niedriger Spannung (≤ 3 V / cm Gel Länge) bis der Farbstoff vor Erreichen ~ 1 cm vom Ende des Gels. Dies wird mehrere Stunden dauern. Es ist wichtig, dass das Gel kühl bleiben, sonst Diffusion von niedermolekularen Proteins (z. B. Monomere) können ihre Nachweisgrenze.
Teil 3: Transfer
- Schneiden Sie ein Stück Nitrozellulose, um die gleichen Abmessungen wie das Gel.
- Cut 20 Stück GB004 und GB002 8 Stück Löschpapier, auf die gleichen Abmessungen wie das Gel. Cut ein zusätzliches Stück GB004 als Docht verwendet werden; es etwa 20 Zentimeter breiter als das Gel.
- Tauchen Sie die Nitrozellulose, Docht und 4 Stück GB002 in 1X TBS.
- In einem Kunststoff-Behälter, montieren Sie einen Stapel von Papieren wie folgt: 20 Stück trockenen GB004, dann 4 Stück trockenes GB002, dann ein Stück vor nassen GB002. Legen Sie die Nitrozellulose auf dieses Stacks.
- Spülen Sie das Gel auf die Gelträger kurz in Wasser, um überschüssiges Laufpuffer zu entfernen. Dann vorsichtig beginnen, um das Gel vor der Tablettrutsche auf den Stapel. Während Sie das Gel aus dem Fach, begießen die Membran mit TBS wie nötig. Die zusätzlichen Puffer verhindert, dass Luftblasen aus Einklemmen unter dem Gel. Ein Transferpipette eignet sich gut für diesen Zweck.
- Nachdem das Gel wurde auf den Stapel verschoben worden ist, sorgfältig überprüfen, ob Luftblasen. Falls vorhanden sind, heben Sie den Rand des Gels und erneut Puffer, bis die Blasen ausgearbeitet werden kann.
- Legen Sie die restlichen drei vorbefeuchtet GB002 Stücke auf dem Gel. Auf gute Kontakt zwischen allen Schichten durch Walzen einer Pipette fest an der Oberseite des Stapels.
- Flank die Übertragung Stack mit zwei erhöhten die Fächer mit TBS. Hängen Sie die Pre-wet Docht über den Stack, so dass jedem Ende der Docht in TBS getaucht ist.
- Decken Sie die versammelten Transfer-Stack mit einem zusätzlichen Kunststoff-Tablett, auf dem Zusatzgewicht (zB eine 500 ml Flasche Wasser).
- Lassen Sie den Transfer für ein Minimum von drei Stunden oder über Nacht gehen.
- Nach der Übertragung kann die Membran durch Standard-Western-Blot-verarbeitet werden.
Spheroplasting Lösung
1,2 M D-Sorbit
0,5 mM MgCl 2
20 mM Tris, pH 7,5
50 mM BME (add frisch)
0,5 mg / ml Zymolyase 100T (add frisch)
coration: underline; "> Lysispuffer
100 mM Tris 7,5
50 mM NaCl
10 mM BME (add frisch)
Protease-Inhibitoren (add frisch)
4X Sample Buffer
2X TAE
20% Glycerin
8% SDS
Bromphenolblau den Vorzug
Discussion
SDD-AGE wurde zuerst von Kryndushkin et al. 1, zu SDS-resistenten Komplexen des Studiums der [PSI +] Prion in Hefe, und hat seitdem große Verbreitung gefunden Studium sowohl Prion-und Nicht-Prion-Aggregate 2-9. Allerdings ist die Übertragung der Proteine auf eine Membran nach Elektrophorese in einem Agarosegel problematisch und kann zu einem verzerrten Bild 5 blot Ergebnis. Darüber hinaus führt die versunkene Elektroblotting Technik am häufigsten verwendeten praktischen Grenzen für die Größe des Gels und damit die Anzahl der Proben, die verarbeitet werden können. Wir haben diese Probleme durch den Einsatz von nach unten Kapillartransfer 10, ein einfaches Verfahren, das einen Stapel von Dry-Blotting Papiere benutzt, um Proteine aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran übertragen gerichtet. Kapillar-Transfer verhindert Verzerrungen und ermöglicht große Gele auf einfache Weise bearbeitet werden. Es gibt ein paar Dinge, die vor über SDD-AGE zu betrachten. Für Rohöl Proben (zB Lysate), wird durch immunologischen Nachweis spezifischer Proteine notwendig. SDD-AGE nicht vollständig denaturiert das Protein-Komplexe von Interesse, so das Protein (s) nachgewiesen werden muss ein Epitop-Tag außerhalb der amyloidogene Region zu tragen. Lysate können in der Regel hergestellt, wie sie für eine normale SDS-PAGE werden würde, mit zwei wichtigen Unterschieden. Zunächst muss darauf geachtet werden, erhöht den Abbau durch Proteolyse zu verhindern. Die teilweise denaturierenden Bedingungen werden dabei nicht ausreichend, um Proteasen zu inaktivieren, und kann auch Zielproteine anfälliger für Proteolyse. Verwenden Sie eine komplette Protease-Inhibitor-Cocktail an mindestens zwei-fache der empfohlenen Konzentration. Zweitens Erwärmung der Proben sollte vermieden werden. Wenn ein all-Monomer negative Kontrolle ist erwünscht, um beispielsweise sicherzustellen, dass hohe Molekulargewicht Arten nicht durch kovalente Modifikationen, eine 10-minütige Inkubation bei 95 ° C eingesetzt werden können, die die meisten Amyloide auf monomeres Protein wird wieder herzustellen.
Acknowledgments
Wir danken Simon Alberti für die Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (GM25874), ein Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (zum SL), und ein National Science Foundation Chemiefonds Ausbildungsförderung (RH) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zymolyase 100T | Seikagaku Corporation | 120493-1 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78429 | |
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | |
| GB004 blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 10427926 | |
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-917 | |
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
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