Summary
SDD-AGE is een nuttige techniek voor de detectie en karakterisering van amyloid-achtige polymeren in de cellen. Hier laten we zien een aanpassing dat maakt deze techniek vatbaar is voor grootschalige toepassingen.
Abstract
Amyloïd aggregatie wordt in verband gebracht met tal van eiwit misfolding pathologieën en ligt ten grondslag aan de infectieuze eigenschappen van prionen, die conformationeel zichzelf templating eiwitten die worden verondersteld om gunstige rollen in lagere organismen hebben. Amyloids zijn notoir moeilijk te bestuderen door hun onoplosbaarheid en structurele heterogeniteit. Echter, resolutie van amyloid polymeren op basis van grootte en detergent onoplosbaarheid mogelijk gemaakt door de semi-denaturerende Detergent-agarosegelelektroforese (SDD-AGE). Deze techniek is het vinden van wijdverbreide gebruik voor de detectie en karakterisering van amyloïde conformationele varianten. Hier tonen we een aanpassing van deze techniek die het gebruik ervan vergemakkelijkt in grootschalige toepassingen, zoals screens voor nieuwe prionen en andere amyloidogenic eiwitten. De nieuwe SDD-AGE methode maakt gebruik van capillaire transfer voor grotere betrouwbaarheid en gebruiksgemak, en kan elke grote gel te worden ondergebracht. Zo kan een groot aantal monsters, bereid uit cellen of gezuiverde eiwitten, gelijktijdig worden verwerkt voor de aanwezigheid van SDS-onoplosbare conformeren van gemerkte eiwitten.
Protocol
Deel 1: Voorbereiden van de gel
- Monteer de gel gieten lade. Standaard uitrusting voor horizontale DNA elektroforese kunnen worden gebruikt. Voor grote aantallen monsters, bereiden we een 20 cm x 24 cm plaat met maximaal vier 50-well kammen. Zorg ervoor dat de plaat geen krassen heeft, want deze kunnen de blot afbeelding te vervormen.
- Maak een 1,5% agarose-oplossing (medium of hoge gel-sterkte, laag EMO) in 1X TAE. Het volume moet voldoende zijn om volledig onder water de kam tanden - wil je zo veel monster belasting mogelijk om detectie te maximaliseren. Magnetron van het mengsel tot de agarose volledig is opgelost.
- Snel toevoegen SDS tot 0,1% ten opzichte van een 10% voorraad. Swirl te mengen. Als sommige agarose stolt tijdens deze stap, weer wordt opgelost met behulp van een kookplaat en wees voorzichtig om te voorkomen dat koken.
- Giet de oplossing in de casting lade. Gebruik een kam te harken uit eventuele luchtbellen, als ze maar konden later interfereren met transfer.
- Na de gel heeft, te verwijderen kammen en plaats de gel in de gel tank. Volledig onderdompelen van de gel in 1X TAE met 0,1% SDS.
Deel 2: Voorbereiding van monsters
- Voor de high-throughput analyse van gist lysaten, beginnen we met 2-ml culturen gedurende de nacht gekweekt met snelle agitatie in 96-well blokken. In dit geval, elke cultuur is overexpressie een eiwit van belang. Bij het analyseren van lage abundantie eiwitten, moet grotere cultuur volumes worden gebruikt
- Oogst cellen door centrifugeren bij 2000 RCF gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Weer Resuspendeer cellen in water en centrifuge.
- Resuspendeer in 1 ml spheroplasting oplossing. Incubeer gedurende ongeveer 30 minuten bij 30 ° C (u kunt spheroplasting efficiency bevestigen met microscopie).
- Centrifugeer bij 800 RCF gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Volledig te verwijderen supernatant.
- Resuspendeer gepelleteerd spheroplasts in 100 ml lysis buffer.
- Bedek het blok met tape en vortex op hoge snelheid gedurende 2 minuten.
- Pellet cellulaire puin bij 4000 RCF gedurende 2 minuten.
- Voorzichtig supernatant te verwijderen om een nieuwe container, bijvoorbeeld, een 96-well PCR-plaat.
- Indien gewenst, bepalen de eiwitconcentratie van de lysaten.
- Voeg 4X sample buffer om de monsters te lysaten met 1X sample buffer te genereren. Incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Lading gel. Indien gewenst, op te slaan helft van de steekproef volume en kook het voor SDS-PAGE analyse. Om de mate van overdracht te controleren later, onder andere een pre-gekleurde SDS-PAGE marker. Bovendien kan een moleculair gewicht marker die bestaat uit een zeer grote eiwitten (bijvoorbeeld kip pectoralis extract) worden gebruikt om de grootte van de complexen opgelost te schatten.
- Op een laag voltage (≤ 3 V / cm gel lengte) tot de kleurstof voorkant bereikt ~ 1 cm van het einde van de gel. Dit zal enkele uren duren. Het is belangrijk dat de gel koud blijven, omdat anders de verspreiding van een laag moleculair gewicht eiwit (bijv. monomeren) kunnen beperken hun detectie.
Deel 3: Overdracht
- Knip een stuk van nitrocellulose met dezelfde afmetingen als de gel.
- Knip 20 stukjes van GB004 en 8 stukjes GB002 vloeipapier, met dezelfde afmetingen als de gel. Snij een extra stukje GB004 om te worden gebruikt als een lont, maken ongeveer 20 centimeter breder dan de gel.
- Dompel de nitrocellulose, lont, en 4 stuks van de GB002 in 1X TBS.
- In een plastic container, assembleren een stapel papieren als volgt: 20 stuks van droge GB004, dan 4 stuks van droge GB002, dan is een stuk van de pre-wet GB002. Leg de nitrocellulose op de top van deze stapel.
- Spoel de gel op de casting bak kort in om het overtollige water loopt buffer te verwijderen. Dan, voorzichtig beginnen met de gel glijden de lade op de stack. Terwijl schuiven de gel uit de lade, blussen het membraan met TBS als nodig is. De extra buffer helpt te voorkomen dat bellen van vast komen te zitten onder de gel. Een overdracht pipet werkt goed voor dit doel.
- Nadat de gel is verplaatst naar de stapel, grondig te controleren op luchtbellen. Als er aanwezig zijn, til de rand van de gel en opnieuw buffer totdat de bellen kunnen worden uitgewerkt.
- Doe de overige drie pre-bevochtigd GB002 stukjes op de top van de gel. Zorg voor een goed contact tussen alle lagen door het werpen van een pipet stevig aan de bovenkant van de stapel.
- Flank de overdracht stapel met twee verhoogde bakken met TBS. Drapeer de pre-nat wiek over de hele stack zodanig dat beide uiteinden van de pit wordt ondergedompeld in TBS.
- Dek de verzamelde overdracht schoorsteen met een extra plastic bak met extra gewicht (bijvoorbeeld een 500 ml fles water).
- Laat de overdracht aan te gaan voor een minimum van drie uur of 's nachts.
- Na de overdracht, kan het membraan worden verwerkt door standaard Western blotting.
Spheroplasting Solution
1,2 M D-sorbitol
0.5 mM MgCl 2
20 mM Tris, pH 7,5
50 mM BME (add vers)
0,5 mg / ml Zymolyase 100T (add vers)
coration: onderstrepen; "> Lysis Buffer
100 mM Tris 7.5
50 mM NaCl
10 mM BME (add vers)
proteaseremmers (toe te voegen vers)
4X Sample Buffer
2X TAE
20% glycerol
8% SDS
broomfenolblauw de voorkeur
Discussion
SDD-AGE werd voor het eerst gerapporteerd door Kryndushkin et al.. 1, aan SDS-resistente complexen van de studie van de [PSI +] prion in gist, en is sindsdien gevonden wijdverbreide gebruik het bestuderen van zowel prion-en non-prionen aggregaten 2-9. Echter, de overdracht van de eiwitten aan een membraan na elektroforese in een agarosegel is problematisch, en kan resulteren in een vertekend blot afbeelding 5. Daarnaast is de verzonken electroblotting techniek die het meest gebruikt introduceert praktische beperkingen voor de grootte van de gel en dus het aantal monsters dat kan worden verwerkt. We hebben deze problemen aangepakt door het gebruik van dalende capillaire overdracht 10, een eenvoudige procedure die een stapel droge blotting papers gebruikt om eiwitten overdracht van de gel tot een nitrocellulose membraan. Capillaire overdracht voorkomt vervorming en zorgt dat grote gels te gemakkelijk worden verwerkt. Er zijn een paar dingen te overwegen voordat u SDD-AGE. Voor ruwe monsters (bijv. lysaten), immunodetectie van specifieke eiwitten nodig. SDD-AGE is niet volledig het eiwit complexen van belang denatureren, zodat het eiwit (s) te detecteren moet een epitoop-tag buiten de regio amyloidogenic dragen. Lysaten kunnen in het algemeen worden bereid als zij zouden worden voor een normaal SDS-PAGE, met twee belangrijke verschillen. Ten eerste moet extra zorg worden genomen om degradatie te voorkomen door proteolyse. De gedeeltelijk denaturerende omstandigheden hier gebruikt zijn niet voldoende om proteasen inactiveren, en kan ook doeleiwitten gevoeliger voor proteolyse. Gebruik een compleet proteaseremmer cocktail op ten minste twee maal de aanbevolen concentratie. Ten tweede, het verwarmen van de monsters moet worden vermeden. Indien een all-monomeer negatieve controle gewenst is, bijvoorbeeld om te bevestigen dat een hoog-moleculair-gewicht soorten die niet zijn te wijten aan covalente modificaties, een 10-minuten incubatie bij 95 ° C kan worden gebruikt, die de meeste amyloids zal herstellen monomere eiwit.
Acknowledgments
Wij danken Simon Alberti voor hulp bij het ontwikkelen van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health (GM25874), een Howard Hughes Medical Institute Investigatorship (tot SL), en een National Science Foundation predoctorale opleiding subsidie (RH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| zymolyase 100T | Seikagaku Corporation | 120493-1 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 78429 | |
| Hybond-C extra nitrocellulose | Amersham | RPN303E | |
| GB004 blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 10427926 | |
| GB002 (3MM Chr) blotting paper | Whatman, GE Healthcare | 3030-917 | |
| Agarose (UltraPure) | Invitrogen | 15510-027 |
References
- Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104. J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).
- Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION. J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).
- Allen, K. D., et al. Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+]. Genetics. 169, 1227-1242 (2005).
- Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation. The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis. Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase. Current Genetics. 49, 21-29 (2006).
- Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids. J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).
- Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability. Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).
- Douglas, P. M., et al. Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).
- Nagy, B., Costello, R., Csako, G. Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping. Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).
