Dissekering av Larvernas CNS i Drosophila melanogaster

Summary

I den här artikeln visar vi hur du kan dissekera det centrala nervsystemet från tredje INSTAR Drosophila larver.

Abstract

Det centrala nervsystemet (CNS) av Drosophila larver är komplex och dåligt förstådd. Ett sätt att undersöka CNS är att använda immunohistokemi för att undersöka uttrycket av olika nya och proteiner markör. Färgning av hela larver är opraktiskt eftersom den tuffa nagelbanden hindrar antikropparna från att tränga in i kroppen hålighet. För att färga dessa vävnader är det nödvändigt att dissekera djuret före fastställande och färgning. I den här artikeln visar vi hur du kan dissekera Drosophila larverna utan att skada nervsystemet. Börja med att riva larven på mitten med ett par fina tång, och slå sedan på nagelband "inside-out" för att avslöja CNS. Om dissektionen utförs noggrant CNS kommer att förbli knuten till nagelbanden. Vi håller oftast CNS knutna till nagelbanden hela fixering och färgning steg, och bara helt ta bort CNS från nagelbanden strax innan montering av prover på objektglas. Vi visar också några representativa bilder av en larver CNS färgas med Eva, en transkriptionsfaktor som uttrycks i en delmängd av nervceller i CNS. Artikeln avslutas med en diskussion av några av de praktiska användningsområden för denna teknik och de potentiella svårigheter som kan uppstå.

Protocol

1. Dissekera 3: ^e INSTAR larver, lämnar CNS knuten till nagelbanden. Placera i ett 1,5 ml rör.
2. Fix i PBS (1x) innehållande 2% formaldehyd i 40 min med gungande. ; Använd 250ul för varje dissekeras 5-10 CNS.
3. Ta bort formaldehyd och kort tvätta tre gånger med PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST). Använd ett fint dras pasteurpipett att undvika förlust av vävnad.
4. Blockera icke-specifik proteinbindning webbplatser och permeabilize cellmembranen genom att inkubera vävnaden 1-8 timmar i PBST + 5% BSA, gunga vid 4 ° C.
5. Inkubera i primära antikroppen späds i PBST + 5% BSA gunga vid 4 ° C över natten. Optimal antikropp utspädning kommer att variera för olika antikroppar.
6. Skölj 3x PBST följt av två 30min tvättar vid 4 ° C.
7. Inkubera i sekundära antikroppen späds i PBST + 5% BSA för 1-3 timmar gunga vid 4 ° C. Skölj 3x PBST följt av två 30min tvättar vid 4 ° C. Om den sekundära är konjugerat till en ljuskänslig förening, linda röret i aluminiumfolie.
8. Dissekera vävnad vidare (om det behövs) och montera på bilder.

Discussion

Denna video visar hur du dissekera CNS från tredje INSTAR Drosophila larver. Efter dissektion kan CNS färgas med en vanlig immunohistokemi protokoll. För närvarande mycket är fortfarande okänt om hur vuxna nervsystemet skapas samt hur den lagrar och överför information. Studier av utvecklingen av Drosophila larver CNS bör öka vår kunskap om nervsystemets ledningar och funktion.

Drosophila larver uppvisar ett antal stereotpyed beteenden, som ett svar på miljö-signaler. Hur är dessa beteenden lärda och lagras i nervsystemet? Studier av nervsystemet under larvernas utveckling bidrar till att besvara denna fråga.

I detta skede i Drosophila utveckling, organismens förbereder sig för att genomgå den stora morfologiska förändringar som sker under pupation. Under denna tid sker stora omdaning av den neuromuskulära systemet som organsim övergångar från en krypande maggot till en vuxen fluga. Det ska bli intressant att se hur nervceller förändras under detta skede av utvecklingen, och om samma typ av beteenden kan observeras i de nervceller i högre djur.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	fine tipped
9-well Watch glass
Plastic Petri dish