Summary
Este video es una demostración técnica del protocolo de hibridación para todo el genoma amplia baldosas CGH camino, que escanea todo el genoma humano utilizando sólo 25 a 100 ng de ADN que se puede aislar de una variedad de fuentes, incluyendo archivos de material fijado en formol.
Abstract
Hibridación amplia genómica comparada (CGH array) es un método para la detección de pérdidas y ganancias de los segmentos de ADN o la dosis del gen en el genoma de uno. Los recientes avances en esta tecnología han permitido la comparación de alta resolución de todo el genoma para la identificación de alteraciones genéticas en el cáncer y otras enfermedades genéticas 2. La Sub-Megabase Resolución mosaico conjunto de matriz (o SMRT) serie se compone de un conjunto de aproximadamente treinta mil superposición de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) clones que abarcan todo el genoma humano en ~ 100 pares de kilobases (kb) segmentos 2. Estos objetivos son BAC individual sintetizados y manchado por duplicado en un portaobjetos de vidrio solo 2-4. Array CGH se basa en el principio de la hibridación de la competencia. Muestra de ADN de referencia y son diferencialmente etiquetados con cianina-3 y colorantes cianina-5 fluorescentes, y co-hibridizada a la matriz. Después de un período de incubación de las muestras no unidos son lavados de la diapositiva y la matriz es fotografiado. Un paquete de software a libre disposición denominado SeeGH (www.flintbox.ca) se utiliza para procesar el gran volumen de datos recopilados - un solo experimento genera 53.892 puntos de datos. SeeGH visualiza la señal log2 relación de intensidad entre las dos muestras en cada objetivo BAC, que se alinea verticalmente con la posición de los cromosomas 5,6. La matriz SMRT puede detectar alteraciones tan pequeños como 50 kb de tamaño 7. La matriz SMRT puede detectar una variedad de eventos de reordenamiento del ADN incluyendo las ganancias de ADN, las pérdidas, amplificaciones y deleciones homocigóticas. Una ventaja única de la matriz SMRT es que uno puede usar el ADN aislado de las muestras en formol fija parafina embebidos. Cuando se combina con los requisitos de entrada bajos de ADN amplificado (25-100 ng) esto permite que el perfil de las muestras preciosas tales como los producidos por microdisección 7,8. Esto se atribuye al gran tamaño de cada objeto de la hibridación BAC, que permite la unión de suficientes muestras etiquetadas para producir las señales para la detección. Otra de las ventajas de esta plataforma es la tolerancia de la heterogeneidad del tejido, la disminución de la necesidad de microdisección de tejidos tedioso 8. Este protocolo de vídeo es un tutorial paso a paso de etiquetado de la entrada de ADN a través de adquisición de señal para el conjunto del genoma mosaico toda SMRT camino.
Protocol
SONDA DE ETIQUETADO
Nota: limitar la exposición de tintes Cye a la luz en todo momento (esto se puede lograr mediante el trabajo en un área oscura o mediante el blindaje de los tubos con una cubierta como una lámina de aluminio)
- Combine:
(Instalación de un tubo de reacción de referencia y un tubo de reacción de la muestra)- ADN (25-400 ng)
- 5 l de tampón 5X cebadores aleatorios (concentración final: 5 veces Promega Klenow de amortiguación y 7 mg / l octamers al azar)
- Diluir a 17,0 l de volumen total con H 2 O destilada
- Hervir durante 10 minutos a 100 ° C. Inmediatamente en hielo durante 1 minuto.
- Agregar 4 L de 10 veces la mezcla de dNTP (2 mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP 1,2 mm).
- Añadir CyeDyes:
- Añadir 2 l (2 nmoles) de Cy-3 dCTP marcado con el ADN de muestras
- Añadir 2 l (2 nmoles) de Cy-5 dCTP marcado con ADN de referencia (por ejemplo, el ADN genómico humano Novagen)
- Añadir 2,5 l de Klenow (9 U / l, Promega) y mezclar.
- Se incuba a 37 ° C durante la noche * (~ 18 horas).
* El tiempo de hibridación noche a la mañana puede ser ajustado entre 14 a 24 horas sin afectar negativamente el proceso de etiquetado para ajustarse a un horario de laboratorio.
Limpieza de la muestra
(Combinado sonda de limpieza y preparación para la hibridación)
- El uso de un Microcon YM-30 columnas:
- Añadir 100 Cot-1 l de ADN (1μg/μL) a la columna. No toque la membrana con la punta de la pipeta.
- Piscina de las reacciones (y muestra) y añadir a la columna.
- Colocar la columna en el tubo siempre y giran a 13.000 g durante 10 minutos.
- Añadir 200 l de H 2 0 destilada a la membrana y repita el giro de lavar.
- Deseche el tubo y añadir solución de hibridación 45 l: (Roche DIG Easy)
- Invertir Microcon, colocarlos en un tubo nuevo etiquetado, y giran a 3000 g por 3 minutos.
CÁLCULO DE INCORPORACIONES
- Quitar 1,5 l y la incorporación medida fluoróforo con espectrofotómetro NanoDrop. Usando su tampón de hibridación como un espacio en blanco (DIG Easy), siga las instrucciones en la pantalla. (Usted puede recuperar la muestra del pedestal, si es necesario, después de la medición.)
(Nota:. Incorporaciones por debajo de 3,0 pmol / l en cualquiera de los canales han mostrado resultados variables) - Desnaturaliza a 85 ° C durante 10 minutos.
- Coloque la sonda a 45 ° C durante 30 minutos a 1 hora (permite Cot-1 ADN recocido.)
ARRAY HIBRIDACIÓN
- Lugar 44 l solución sonda en el cubreobjetos (22 mm x 60 mm) (Fisher Scientific). Si es posible, colocar el cubreobjetos sobre un portaobjetos caliente o bloque de calor pre-calentado a 45 ° C para mantener la temperatura.
- Alinear a deslizarse sobre cubreobjetos y solución de la sonda, baja uno de los bordes de la diapositiva permite el contacto con la solución de hibridación. Continúe bajando hasta que el cubreobjetos se adjunta a la diapositiva con la tensión superficial. Invertir diapositivas.
- Colocar la placa en casete de hibridación (Telechem), pre-calentado a 45 ° C, y se añaden 10 l de agua en el surco menor (para controlar la humedad durante la hibridación).
- Sello de cassette y se incuba durante 36 a 40 horas a 45 ° C.
ARRAY DE LAVADO
Nota: Todas las soluciones de lavado se encuentran en un pH de 7,0
La eliminación de la diapositiva de la cassette de la hibridación es fundamental. DIG fácil cristaliza rápidamente a temperatura ambiente. La diapositiva debe ser inmediatamente sumergido y el cubreobjetos eliminado en la solución de lavado.
- Añadir aproximadamente 60 ml de 0.1XSSC, 0,1% SDS (pH 7.0, 45 ° C) la solución de lavado a una jarra de Coplin antes de abrir la cámara de hibridación.
- Abrir la cámara, añadir diapositivas a la solución de lavado y eliminar cubreobjetos (debe deslizar).
- Lave el carro 3 veces en 0.1XSSC + 0,1% SDS a 45 ° C durante 1 minuto con agitación.
- Lave la lámina 3 veces en 0.1XSSC fresco *. No debe haber burbujas residuales del lavado de SDS visible.
* Las diapositivas pueden permanecer en la solución de lavado final hasta que esté listo para centrifugar y análisis (~ 15 minutos). - Centrifugar la diapositiva en un tubo Falcon de 50 ml a 700 g por 3 minutos.
- Inmediatamente escaneo de las diapositivas (intensidad de la señal disminuirá con el tiempo.)
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Discussion
ADN de mala calidad no proporcionan un perfil de hibridación bien. Es esencial para asegurar que la muestra de ADN de referencia y están libres de contaminantes tales como el ARN fenol, sal, etc, que pueden interferir con el paso de etiquetado primer azar antes de iniciar un experimento de hibridación. Por ejemplo, la resuspensión de ADN en Tris - EDTA (TE) en lugar de agua no se recomienda como alta concentración de sal puede inhibir la reacción de marcaje. Se recomienda ensayar la calidad del ADN utilizando el espectrofotómetro Nanodrop para medir tanto la cantidad de ADN, así como la forma general de la curva de absorción y el 260/280, 260/230 relación.
Lavado: Eliminación de la diapositiva de la cassette de la hibridación y la transferencia a la solución de lavado caliente es un paso crítico en el proceso de hibridación como la solución de hibridación DIG fácil cristaliza muy rápidamente. Es importante que las soluciones de lavado que a un pH neutro y la temperatura de la solución de lavado es importante para el rigor, mientras se quita la sonda no unido. Tras el secado se desliza es importante para mantenerlos en la oscuridad si no está buscando de inmediato o después de la exploración si lo desea para volver a examinar en un momento posterior.
Ozono: El ozono ha sido una preocupación en todo el mundo al realizar CGH array. Los niveles de ozono por encima de 5 ppm se ha demostrado que afectan negativamente a los tintes Cye. Cye 5 es particularmente sensible a la degradación de la capa de ozono. Minimizar la exposición al ozono es fundamental para prevenir la degradación del tinte Cye y la pérdida de la señal antes y durante la exploración. De exploración en la noche por ejemplo, cuando la capa de ozono ambiental es generalmente más bajos, es una opción posible. Recintos de la capa de ozono libre de diapositivas automático de lavado y exploración de diapositivas y varios tratamientos químicos están disponibles comercialmente. Colorantes resistentes al ozono Cye Recientemente también se han desarrollado.
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Acknowledgments
Queremos agradecer a los miembros del equipo Wan Lam matriz Laboratorio BAC especialmente Miwa Suzuki y Chi Bryan para la preparación de este artículo. Este trabajo fue financiado por los fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, Canadá Genoma / Genoma Columbia Británica, y el NIH / NIDCR subvención RO1 DE15965-01.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 5X Klenow Buffer | Reagent | Promega Corp. | ||
| Random Octamers | Reagent | Alpha DNA | ||
| 10X dNTP mix | Reagent | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| Cy-3 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Cy-5 labeled dCTP | Reagent | GE Healthcare | ||
| Human Genomic DNA Reference | Reagent | Novagen, EMD Millipore | Example of a possible reference | |
| Klenow | Reagent | Promega Corp. | ||
| YM-30 Column | Reagent | EMD Millipore | ||
| Cot-1 DNA | Reagent | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Reagent | Roche Group | ||
| Sheared Herring Sperm DNA | Reagent | Promega Corp. | ||
| Coverslip | Reagent | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Hybridization Cassette | Tool | Telechem |
References
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13 (2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243 (2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
