Summary
De dissectie en de groei van cellen van een persoon hersengebied vergemakkelijkt onderzoek van cellulaire en fysiologische parameters. We beschrijven een methode voor primaire celcultuur dat neuron verrijkte culturen produceert in een serum-vrije omgeving.
Abstract
De fysiologische eigenschappen van de hippocampus neuronen worden vaak onderzocht, met name vanwege de betrokkenheid van de hippocampus bij leren en geheugen. Primaire hippocampus cel kweken laat neurowetenschappers te onderzoeken van de activiteit en de eigenschappen van neuronen in de individuele cel en enkele synaps niveau. In deze video, zullen we zien hoe te isoleren en te groeien primaire hippocampus cellen van pasgeboren ratten. De hippocampus kan worden geïsoleerd van elk pasgeboren dier in zo kort als 2 tot 3 minuten, en de culturen kan worden gehandhaafd voor maximaal twee weken. We zullen ook kort laten zien hoe je deze hippocampale neuronen voor ratiometrische calcium beeldvorming te gebruiken. Hoewel dit protocol beschrijft het proces voor de hippocampus, met weinig tot geen wijzigingen, kan deze worden toegepast op andere gebieden van de hersenen.
Protocol
Voorafgaand aan de hippocampus isolatie
Voor het begin van de hippocampus isolatie, zorg ervoor dat alle tools steriel zijn. Spray beneden de cultuur kap met 70% ethanol, en zet de tools in de kap. U moet 6 - en 10-cm Petrischalen, steriele poly-L gecoat glas dekglaasjes, Pipetten en tips, wegwerp pipetten, en een elektrische pipet. Vanaf dit punt, denk om de juiste steriele techniek te gebruiken.
- Zet het waterbad en zorg ervoor dat het wordt verwarmd tot 37 ° C.
- De volgende oplossingen die worden opgeslagen bij 4 ° C nodig zullen zijn:
- Modified Eagle's Medium (MEM)
- Neurobasal
- Gebufferde zoutoplossing Hank's oplossing (HBSS)
- Boraatbuffer oplossing
- Natriumpyruvaat oplossing
- Steriel gefiltreerd 20% glucose-oplossing in gedestilleerd water
- Zorg ervoor dat alle flessen spuit af met 70% ethanol voordat u ze in de motorkap.
- Neem deze bevroren oplossingen uit de vriezer en leg ze in een verwarmd waterbad:
- Een 5 ml van paard serum
- Een 1 ml van B-27 aan te vullen
- Een 1 ml van 100X antibiotica (penicilline plus streptomycine)
- En een 0,5 ml van L-glutamine
- Nadat de oplossingen hebben ontdooid, neem ze uit het waterbad, spuit ze naar beneden met 70% ethanol, en plaats ze in de motorkap. Nu de beplating en Neurobasal medium kan worden bereid.
- Nadat de oplossingen worden voorbereid, stevig kapje van de containers en plaats ze in de 37 ° C bad op te warmen tijdens het uitvoeren van de hippocampus isolatie.
- Ook, neem een hoeveelheid van de protease trypsine (2,5%) uit de vriezer en plaats deze in het waterbad. Trypsine zal verteren de ontleed hippocampus, die zal worden geïsoleerd in de volgende stap.
- Neem een 15 ml conische buis, vul het met HBSS, en label het met de behandelde groep. Het is hier dat geïsoleerd hippocampus worden verzameld in de volgende stap.
Hippocampus Isolatie
- Om te beginnen de hippocampus isolatie, zorg ervoor dat pasgeboren pups schoon zijn en hebben hun melk bands, placenta's en navelstrengen verwijderd door hun moeder.
- Plaats de pups in een petrischaal, spray met 70% ethanol schoon te maken, en plaats ze in de kap. De dieren onmiddellijk gedood voor de kweek.
- Voor verdere sterilisatie neem een pup uit de schotel, dip de pup in 70% ethanol, en vervolgens in twee wasbeurten van steriele HBSS.
- Verwijder de kop van het lichaam met een schaar. Met dezelfde schaar, knippen door de huid en de schedel.
- Met behulp van een paar fijne pincet, schil de schedel uit de buurt van de hersenen en plaats de hersenen in een kleine petrischaal dat een kleine hoeveelheid van een steriele HBSS bevat.
- Trek de hersenhelften. De hippocampus is een kleine, seahorse-vormige structuur in de mediale temporale kwab.
- Verwijder de hippocampus en plaats in 3 ml van HBSS in een 15 ml buis. Herhaal deze stappen met elke pup, en leg elk geïsoleerd hippocampus in de 15 ml buis. Nu is het tijd om het weefsel te dissociëren individuele cellen.
Hippocampus cel dissociatie
- Nadat alle hippocampus zijn geïsoleerd, vul de 15 ml buis 4,5 ml met HBSS.
- Haal de trypsine uit het waterbad, spray met ethanol, en plaats in de motorkap. Voeg 0,5 ml trypsine aan de buis, en gedurende 15 minuten bij 37 ° C. incubeer
- In de kap, verwijder dan de HBSS / trypsine-oplossing uit de buis met een steriele pipet, zorg dat u de hippocampus die zich hebben gevestigd op de bodem van de buis te verstoren. Voeg 5 ml van HBSS aan de buis en schud zachtjes. Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Twee keer herhaalt u deze stap, het verwijderen van de oude HBSS en vervangen door verse oplossing.
- Neem een hoeveelheid van DNAse I uit de vriezer. Voeg 0,5 ml DNase aan de hippocampus in 4,5 ml HBSS. De DNAse wordt toegevoegd aan enzym inactivatie te bevorderen.
- Vermaal de oplossing (of pipet op en neer) tot het homogeen is. Wees niet te bellen introduceren in het homogenaat.
- Bepaal levensvatbaarheid van de cellen met de trypan blauw uitsluiting methode.
- Neem een 10 cm petrischaal met 6-8 dekglaasjes, en voeg 10 ml in de platen medium. Pipetteer het gewenste aantal cellen om het schaaltje met de dekglaasjes. Roer voorzichtig om de cellen te verspreiden, en zorg ervoor dat de dekglaasjes elkaar niet overlappen.
- Laat de cellen om voor 2-4 uur in een vochtige 37 ° C incubator bevestigen met 5% CO 2. Na het bevestigen dat de cellen levensvatbaar zijn en hebben gehecht, transfer de dekglaasjes om individuele schotels met Neurobasal medium. Terug te plaatsen deze gerechten in de couveuse.
- Eenmaal per week, vervang een derde van het medium met vers Neurobasal medium en experimentele behandelingen, als nodig is. Nu, de functionele eigenschappen van deze cellen in cultuur zijn klaar om te worden onderzocht.
Fura-2 Calcium Imaging van de hippocampus Neuronen
- Na gekweekte hippocampale neuronen zijn in vitro voor 48 uur (maar niet eerder), kan calcium imaging experimenten te beginnen. Op dit punt moet deze neuronen zijn begonnen met processen uit te breiden. De optimale leeftijd voor calcium beeldvorming is vanaf de eerste dag in vitro 3 tot 7.
- Laad culturen met Fura-2 AM gedurende 30 minuten bij 37 ° C, waarna ze kunnen worden afgebeeld in een 20X objectief met behulp van een Xenon booglamp op de calcium-indicator kleurstof en een 512 bit CCD-camera, waarvan monsters elke 150 ms te wekken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol werd ontwikkeld als een wijziging van het baanbrekende werk van Gary Banker en Kim Goslin 1. Dit boek is een essentiële bron voor iedereen die geïnteresseerd is in het kweken van cellen - niet alleen de neuron-verrijkte culturen beschreven in het huidige protocol.
De drie meest kritische factoren in cel kweken zijn: steriliteit, snelheid, de keuze van de gebruikte medium.
Steriliteit - een laminaire flow / steriele kap, aseptische omstandigheden, en een steriele incubator zijn verplicht. Besmetting bij elke stap is schadelijk niet alleen voor de huidige experiment waaraan u werkt, maar ook op het daaropvolgende werkzaamheden die zijn gepland. Na een incubator vervuild raakt, kan het weken duren (of een maand) om het te krijgen gereinigd en steriel. Verontreiniging, terwijl het niet onmiddellijk duidelijk op een zichtbare niveau, zal zeker invloed hebben op levensvatbaarheid van de cellen en cel-fysiologie. Steriliteit is noodzakelijk.
Snelheid - de gezondheid van de gekweekte cellen is sterk gebonden aan de hoeveelheid tijd die de cellen niet in een sfeer-en medium gecontroleerde omgeving. Daarom is het essentieel dat de hoeveelheid tijd die nodig is om cellen van het dier te verwijderen totdat de cellen in de beplating medium is minimaal. Omdat een groot aantal stappen kunnen niet worden veranderd (tijd in incuberen in trypsine of gewassen), wat kan worden gewijzigd is de hoeveelheid tijd die nodig is om de cellen van de hersenen te verwijderen. Vaak de praktijk van de dissectie. De hoeveelheid tijd die nodig is voor deze stap moet worden reproduceerbaar.
Keuze van medium - er zijn talrijke farmaceutische mediums, waarvan er een Neurobasal. Voorafgaand aan de dag van het gebruik van Neurobasal, gliale geconditioneerd medium (wat nodig is om afzonderlijk te worden gemaakt - dit is besproken in het boek van Banker en Goslin 1) nodig was. Hoe dan ook, is het belangrijk dat u weet wat er in het medium dat wordt gebruikt. Samen met Neurobasal, een supplement zoals B-27 wordt vaak gebruikt. Zorg ervoor dat de bestanddelen van deze medium en supplementen bekend zijn, want deze kunnen invloed hebben op de eigenschappen van de cellen. Het is gangbare praktijk in mijn lab aan serum vrij / antraciet gestript / fenolrood vrij medium te gebruiken om steroïde hormonen (gezien het feit dat een groot deel van de werkzaamheden in mijn lab de acties van steroïde hormonen onderzoekt) te vermijden. Dit concept - weten wat er in de oplossingen die u gebruikt - is van cruciaal belang voor alle stappen in cel kweken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JLN werd ondersteund door MH 68347.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
