תרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות P0 יילוד

Summary

דיסקציה וצמיחה של תאים מאזור המוח הפרט מאפשר חקירה של פרמטרים פיזיולוגיים הסלולר. אנו מתארים שיטה culturing התא הראשוני שמייצר נוירון מועשר תרבויות בסביבה בסרום חופשי.

Abstract

המאפיינים הפיזיולוגיים של נוירונים בהיפוקמפוס נחקרות כלל, בעיקר בגלל מעורבותו של ההיפוקמפוס בלמידה ובזיכרון. תא ראשי culturing בהיפוקמפוס מאפשר מדעני מוח כדי לבחון את פעילות ומאפיינים של הנוירונים בתא הבודד וברמת סינפסה אחת. בסרטון זה נדגים כיצד לבודד ולגדל תאים בהיפוקמפוס של חולדות ראשוני לרך הנולד. ההיפוקמפוס עשוי להיות מבודד כל חיה הנולד בקיצור כמו 2 עד 3 דקות, ואת התרבויות יכול להישמר לתקופה של עד שבועיים. אנו גם בקצרה להדגים כיצד להשתמש אלה נוירונים בהיפוקמפוס הדמיה סידן ratiometric. בעוד פרוטוקול זה מתאר את התהליך עבור בהיפוקמפוס, עם קצת שינוי לא, זה יכול להיות מיושם על אזורים אחרים של המוח.

Protocol

לפני בידוד בהיפוקמפוס

לפני תחילת הבידוד בהיפוקמפוס, לוודא שכל הכלים הם עקרים. תרסיס את מכסה המנוע תרבות עם אתנול 70%, ואת המקום כלים בתוך מכסה המנוע. יהיה עליך 6 - ו 10 ס"מ צלחות פטרי, סטרילי poly-L coverslips זכוכית מצופה, pipettors וטיפים, טפטפות חד פעמיות, וכן pipettor חשמלי. מנקודה זו והלאה, לזכור להשתמש בטכניקה סטרילית הנכון.

1. הפעל את האמבטיה במים ולוודא כי הוא מחומם עד 37 ° C.
2. הפתרונות הבאים המאוחסנים ב 4 ° C, יהיה צורך:
   • השתנה הנשר של בינוני (ממ)
   • Neurobasal
   • האנק של שנאגרו מלוחים פתרון (HBSS)
   • Borate פתרון חיץ
   • Pyruvate נתרן פתרון
   • סינון סטרילי גלוקוז פתרון של 20% מים מזוקקים
     
     
   • הקפידו לרסס את כל הבקבוקים למטה עם אתנול 70% לפני הכנסתם למכסה המנוע.
     
     
3. קח את אלה פתרונות קפוא מהמקפיא ומניחים אותם באמבט מים חמים:
   • Aliquot 5 מ"ל של סרום סוס
   • 1 מ"ל aliquot של תוסף B-27
   • 1 מ"ל aliquot של אנטיביוטיקה 100x (הפניצילין בתוספת סטרפטומיצין)
   • וגם 0.5 מ"ל aliquot של גלוטמין-L
4. אחרי פתרונות יש להפשיר, לקחת אותם מתוך האמבטיה מים, ריסוס אותם עם 70% אתנול, ולמקם אותם בשכונה. כעת בינוני ציפוי Neurobasal יכול להיות מוכן.
5. אחרי פתרונות מוכנים, כובע מכולות בחוזקה ומניחים אותם על 37 ° C אמבטיה להתחמם בעת ביצוע הבידוד בהיפוקמפוס.
6. כמו כן, לקחת aliquot של טריפסין פרוטאז (2.5%) מן המקפיא ומניחים אותו באמבט מים. טריפסין יהיה לעכל את ההיפוקמפוס גזור, אשר יהיה מבודד לשלב הבא.
7. קחו צינור חרוטי 15 מ"ל, למלא אותו HBSS, ותווית עם בקבוצת הטיפול. זה המקום שבו מבודדים hippocampi ייאספו בשלב הבא.

בהיפוקמפוס בידוד

1. כדי להתחיל את הבידוד בהיפוקמפוס, ודא לגורים שזה עתה נולדו נקיים היו להקות חלב שלהם, השליות, ואת חבלי הטבור הוסר על ידי אמם.
2. מניחים את הגורים בצלחת פטרי, תרסיס עם אתנול 70% לנקות, ולמקם אותם בשכונה. בעלי חיים מומתים מיד לפני culturing.
3. עבור עיקור נוסף לקחת אחד הגור מצלחת, לטבול את הגור לתוך אתנול 70%, ולאחר מכן לשתי שוטף של HBSS סטרילית.
4. הסר את הראש מן הגוף במספריים. בעזרת מספריים אותו, חותכים דרך העור את הגולגולת.
5. בעזרת פינצטה בסדר, קליפת הגולגולת מן המוח במקום את המוח לתוך צלחת פטרי קטנה המכילה כמות קטנה של HBSS סטרילית.
6. פיל האחורי אונות המוח. ההיפוקמפוס הוא קטן, סוסון ים בצורת מבנה באונה הרקתית המדיאלי.
7. הסר את ההיפוקמפוס מקום לתוך מ"ל 3 של HBSS בצינור 15 מ"ל. חזור על שלבים אלה עם כל הגור, והמקום כל ההיפוקמפוס מבודדים לתוך שפופרת 15 מ"ל. עכשיו, הגיע הזמן לנתק את רקמות תאים בודדים.
   

תאים בהיפוקמפוס דיסוציאציה

1. אחרי הכל hippocampi להיות מבודדים, למלא את שפופרת 15 מ"ל עד 4.5 מ"ל עם HBSS.
2. הסר את טריפסין מהאמבטיה מים, ריסוס עם אתנול, ומניחים מכסה המנוע. הוסף 0.5 מ"ל של טריפסין אל הצינור, דגירה במשך 15 דקות על 37 ° C.
3. ב למכסה המנוע, הסר את הפתרון HBSS / טריפסין מהצינור עם פיפטה סטרילית, נזהר לא להפריע hippocampi כי התיישבו אל החלק התחתון של הצינור. הוסף 5 מ"ל של HBSS אל הצינור מערבולת בעדינות. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
4. חזור על פעולה זו פעמיים, הסרת HBSS הישן ולהחליף עם פתרון חדש.
5. קח aliquot של DNAse אני מהמקפיא. הוסף 0.5 מ"ל של DNase את hippocampi ב 4.5 HBSS מ"ל. DNAse מתווספת לקדם איון האנזים.
6. Triturate הפתרון (או פיפטה למעלה ולמטה) עד שהיא הומוגנית. היזהר לא להכניס בועות לתוך homogenate.
7. קביעת כדאיות התא עם שיטת הרחקה trypan כחול.
8. קחו 10 ס"מ צלחת פטרי המכילה 6-8 coverslips, ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום ציפוי. פיפטה את המספר הרצוי של תאים תבשיל המכיל את coverslips. מערבולת בעדינות כדי לפזר את התאים, ולוודא coverslips אינם חופפים.
9. אפשר התאים לצרף עבור 2-4 שעות humidified 37 ° C חממה עם 5% CO _2. לאחר אישור התאים קיימא יש המצורפת, העברת coverslips למנות אדם המכיל בינוני Neurobasal. מניחים את הכלים האלה לתוך החממה.
10. פעם בשבוע, להחליף שליש בינוני עם בינוני Neurobasal טריים טיפולים ניסיוניים, לפי הצורך. עכשיו, את המאפיינים תפקודית של תאים אלה בתרבות מוכנים להיחקר.

Fura-2 סידן הדמיה של נוירונים בהיפוקמפוס

1. לאחר נוירונים בהיפוקמפוס תרבותי כבר במבחנה במשך 48 שעות (אך לא קודם לכן), הדמיה ניסויים סידן יכולה להתחיל. בשלב הזה, הנוירונים האלה צריך להתחיל להרחיב את התהליכים. טווח הגיל האופטימלי עבור הדמיה סידן מיום במבחנה 3-7.
2. תרבויות טען עם Fura, 02:00 במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, לאחר שהם ניתן הדמיה תחת המטרה 20X באמצעות מנורת קשת קסנון לרגש מחוון סידן צבע ומצלמה CCD 512 ביט, אשר דגימות כל 150ms.

Discussion

פרוטוקול זה פותח כשינוי העבודה הזרע של גארי בנקאי וקים Goslin ^1. ספר זה הוא משאב חיוני עבור מי שמעוניין תאים culturing - לא רק נוירון מועשר תרבויות המתואר בפרוטוקול הנוכחי.

שלושת הגורמים הקריטיים ביותר culturing התא הם: עקרות מהירות, הבחירה של שימוש בינוני.

עקרות - זרימה למינרית / ברדס סטרילי, תנאי aseptic, וכן חממה סטרילי נדרשים. זיהום בשלב כלשהו הוא מזיק לא רק בניסוי הנוכחי אתה עובד, אלא גם את העבודה הבאים שייתכן המתוכנן. לאחר באינקובטור הופך מזוהם, זה יכול לקחת שבועות (או חודש) כדי לקבל אותו לנקות סטרילית. זיהום, בעוד לא ניכר מיד לעין ברמה, יהיה בהחלט להשפיע על הכדאיות של התא ופיזיולוגיה התא. עקרות הכרחי.

מהירות - בריאותם של תאים בתרבית קשורה קשר הדוק כמות הזמן התאים אינם באווירה סביבה מבוקרת בינוני. לכן, חיוני כי משך הזמן הנדרש כדי להסיר את התאים מן החיה עד התאים במדיום ציפוי היא לכל הפחות. בגלל צעדים רבים לא ניתן לשנות (זמן דוגרים ב טריפסין או להיות שטף), מה ניתן לשנות הוא משך הזמן הנדרש כדי להסיר את התאים במוח. עיסוק לנתיחה לעתים קרובות. משך הזמן הנדרש לשלב זה צריך להיות לשחזור.

הבחירה של המדיום - יש מדיומים קניינית רבים, שאחד מהם הוא Neurobasal. לפני ימים של שימוש בינוני Neurobasal, מותנה גליה (אשר צריכה להיעשות בנפרד - זה נדון בספר על ידי הבנקאי Goslin ¹⁾ היה צורך. בכל מקרה, חשוב כי אתה יודע מה הוא המדיום אשר נמצא בשימוש. יחד עם Neurobasal, תוסף כגון B-27 משמש לעתים קרובות. ודא כי המרכיבים של המדיום אלה תוספי ידועים, כפי שהם עשויים להשפיע על המאפיינים של התאים. זה מקובל במעבדה שלי להשתמש בסרום פחם פנוי / חשוף / פנול אדום בינוני חינם להימנע הורמונים סטרואידים (בהתחשב בכך חלק גדול של העבודה שבוצעה במעבדה שלי חוקר את פעולותיו של הורמונים סטרואידים). תפיסה זו - לדעת מה נמצא את הפתרונות שאתה משתמש - הוא קריטי עבור כל השלבים culturing התא.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiotic antimitotic	Invitrogen	15240062
B-27 Supplement	Invitrogen	17504044	Serum free
Boric Acid	Sigma-Aldrich	B6768
Dnase I	Sigma-Aldrich	DN25
Fura-2, AM cell permeant	Molecular Probes, Life Technologies	F1221
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HBSS (10X)	Invitrogen	14185052
HEPES	Invitrogen	15630080
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
MEM	Invitrogen	51200038
Neurobasal	Invitrogen	12348017	Without phenol red
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6282
Pyruvic Acid	Sigma-Aldrich	P2256
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
Sodium Tetraborate	Sigma-Aldrich
Trypsin, 2.5% (10X)	Invitrogen	15090046