Summary
解剖和个人的大脑区域的细胞的生长，促进细胞和生理参数的调查。我们描述了一个初级细胞培养的方法，在无血清环境产生的神经元丰富的文化。
Abstract
通常调查海马神经元的生理特性，特别是由于在学习和记忆的海马的参与。海马细胞培养，允许神经学家研究在单个细胞和单突触水平的神经元的活动和属性。在这段视频中，我们将演示如何隔离和成长从新生大鼠海马细胞。海马可能是孤立的，从每个新生动物在短短2至3分钟，和文化可以保持长达两个星期。我们还将简要演示了如何使用这些海马神经元的比例钙成像。虽然这一协议描述为海马的过程中，几乎没有修改，它可以被应用到大脑的其他地区。
Protocol
此前海马隔离
海马隔离开始之前，确保所有的工具是无菌的。喷雾用70％乙醇的文化的油烟机，并置于罩内的工具。您将需要6 - 10厘米的培养皿，无菌聚L镀膜玻璃盖玻片，移液器和技巧，一次性移液器，电动移液器。从这个角度上，记得要使用正确的无菌技术。
- 打开水洗澡，并确保它被加热到37℃
- 下面的解决方案，保存在4 ° C，将需要：
- 改良Eagle培养基（MEM）
- Neurobasal
- 汉克的缓冲的盐溶液（HBSS）
- 硼酸盐缓冲液
- 丙酮酸钠溶液
- 在蒸馏水中的无菌过滤20％葡萄糖溶液
- 确保所有的瓶子放置在引擎盖前喷用70％乙醇。
- 取出冷冻的这些冻结的解决方案，并放置在一个恒温水浴：
- 一个马血清5毫升分装
- 一个B - 27的补充1毫升分装
- 1毫升等分的100X抗生素（青霉素加链霉素）
- 和L -谷氨酰胺0.5毫升分装
- 解冻的解决办法后，取出来的水洗澡，喷用70％乙醇，并将其放置在引擎盖。现在可以准备电镀和Neurobasal媒介。
- 的解决方案准备完毕后，盖的容器紧紧地放置在37℃水浴热身，同时执行海马隔离。
- 另外，取出的冰柜的蛋白酶胰蛋白酶（2.5％）等分，并放置在水浴。胰蛋白酶消化解剖海马，下一步将在隔离。
- 以15毫升锥形管，它填补的HBSS，治疗组和标签。正是在这里隔离海马将在下一步的收集。
海马隔离
- 要开始海马隔离，确保新生幼崽是干净的，有他们的牛奶乐队，胎盘，并删除他们的母亲的脐带。
- 放置在培养皿中的幼崽，喷用70％乙醇清洗，放置在引擎盖。动物安乐死立即前培养。
- 如需进一步消毒，采取一个小狗的菜，沾小狗到70％的乙醇，然后进入无菌的HBSS洗涤。
- 删除从身体，用剪刀头。使用相同的剪刀，穿过皮肤和颅骨。
- 使用一双细镊子，剥离颅骨远离大脑，把大脑变成一个小型的培养皿中，包含少量无菌的HBSS。
- 剥开大脑半球。海马是一个小型的内侧颞叶，海马状结构。
- 海马和地点分为3毫升15毫升管的HBSS中删除。每个小狗重复这些步骤，每一个孤立的海马放入15毫升管。现在，它是游离于组织单细胞的时间。
海马细胞的解离
- 毕竟海马已被隔离，填补了15毫升管4.5毫升的HBSS。
- 取出从水浴中，用乙醇喷雾，并在引擎盖的胰蛋白酶。管加入0.5毫升的胰蛋白酶，15分钟在37 ° C。
- 在引擎盖上，从管中删除的HBSS /胰蛋白酶液，用无菌吸管，小心不要去打扰的相继落户到试管底部的海马。加入5毫升的HBSS管和涡流轻轻。在37 ° C孵育5分钟。
- 重复此步骤两次，删除旧的HBSS，并更换新鲜的溶液。
- 以我出的DNA酶等分的冰柜。 4.5毫升的HBSS中加入0.5毫升的DNA酶的海马。添加到促进DNA酶是酶失活。
- 磨碎的解决方案（或吸管达上下），直到它被同质。要小心不要引入气泡匀浆。
- 与台盼蓝排除法确定细胞活力。
- 以10厘米的培养皿中含有6至8盖玻片，并添加10毫升的电镀液。移液器所需的细胞数量的菜含有盖玻片。轻轻地分散细胞的漩涡，并确保盖玻片不重叠。
- 允许的细胞附着在饱和湿度37℃培养箱中培养2-4小时，用5％的CO 2 。确认后，这些细胞是可行和有附加，转移盖玻片个别菜肴含有Neurobasal中等。进入孵化器，将这些菜。
- 每周一次，更换三分之一的中型新鲜Neurobasal中和试验性治疗，如需要。现在，在培养这些细胞的功能特性加以研究。
FURA - 2的海马神经元钙成像
- 后48小时（但不得早） 在体外培养海马神经元钙离子成像实验就可以开始。此时，这些神经元已经开始扩展过程。钙成像的最佳年龄范围是从体外3日至7 。
- FURA - 2负载的文化AM在37 ° 30分钟，之后，他们可以根据一个20X使用氙弧灯来激发钙指示剂和一个512位的CCD相机，样本每150毫秒的目标成像。
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Discussion
该协议被修改的开创性工作银行家加里和金Goslin 1。这本书是一个重要的资源在培养细胞有兴趣的人 - 不仅在目前的协议描述的神经丰富的文化。
细胞培养的三个最关键的因素是：不育，速度，介质的选择使用。
不育 -层流/无菌罩，无菌条件下，无菌孵化器是必需的。污染不仅不利于目前的实验工作，但也可能已计划的后续工作，在任何步骤。孵化器已被污染后，它可能需要数周（或一个月），清洁和无菌。污染，而不是立即可见的水平明显，肯定会影响细胞活力和细胞生理学。不育是势在必行。
速度 -培养细胞的健康是紧密相连的时间，细胞的氛围和中期控制环境。因此，它是必不可少的，从动物中删除，直到在电镀液中的细胞的细胞所需的时间至少是。因为有许多的步骤不能改变，在孵化中的胰蛋白酶或被冲走的时候，什么可以改变的是删除从大脑细胞所需的时间量。经常练习解剖。这一步所需的时间量需要可重复的。
介质的选择 -有许多专有媒介，其中之一是Neurobasal。天使用Neurobasal，胶质细胞条件培养基（需要单独作出之前-这是讨论的银行家和Goslin 1书）是必要的。无论如何，重要的是你知道什么是在正在使用的介质。随着Neurobasal，如B - 27的一个补充，是经常被使用。确保中期和补充这些成分是已知的，因为它们可能会影响细胞的属性。在我的实验室使用无血清/炭剥离/酚红培养基，以避免类固醇激素（在我的实验室完成的工作，大部份类固醇激素的行为进行调查），它是标准的做法。 - 知道什么是解决方案，您使用的是-这个概念是在细胞培养中的所有步骤的关键。
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Acknowledgments
JLN支持68347氢。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
