Summary
Рассечение и роста клеток от отдельной области мозга облегчает исследование клеточных и физиологических параметров. Мы опишем метод культивирования первичных клетка, которая производит нейрона обогащенного культур в свободной от сыворотки среде.
Abstract
Физиологических свойств нейронов гиппокампа, как правило, изучения, в особенности из-за участия гиппокампа в процессе обучения и памяти. Первичная гиппокампа культивирования клеток позволяет неврологи изучить деятельность и свойств нейронов на отдельные клетки и одного уровня синапс. В этом видео мы продемонстрируем, как изолировать и выращивать первичные клетки гиппокампа новорожденных крыс. Гиппокампе может быть изолированы друг от новорожденных животных в максимально короткий от 2 до 3 минут, и культуры могут быть сохранены на срок до двух недель. Мы также вкратце показать, как использовать эти нейроны гиппокампа для логометрических изображений кальция. Хотя этот протокол описывает процесс гиппокампа, с практически никаких изменений, он может быть применен в других регионах мозга.
Protocol
До гиппокампа изоляции
Перед началом гиппокампа изоляции, убедитесь, что все инструменты стерильны. Спрей вниз культуры капюшон с 70% этанола и поместить средства внутри капота. Вам нужно будет 6 - и 10-см чашки Петри, стерильные поли-L покрытием покровные стекла, пипетки и советы, одноразовые пипетки и электрических пипетки. С этой точки зрения, не забывайте использовать правильный метод стерильных.
- Включите водяной бане и убедитесь, что она нагревается до 37 ° C.
- Следующие решения, которые хранятся при температуре 4 ° С, будет необходимо:
- Измененный Орла Средняя (MEM)
- Neurobasal
- Буферный солевой раствор Хэнка решение (HBSS)
- Борат буферного раствора
- Раствор натрия пируват
- Стерильные фильтром 20% раствора глюкозы в дистиллированной воде
- Убедитесь в том, чтобы распылить все бутылки вниз с 70% этанолом до размещения их в капот.
- Возьмите эти замороженные растворы из морозильника и поместить их в ванну нагревают воду:
- 5 мл аликвоту лошадиной сыворотки
- 1 мл аликвоту B-27 дополнения
- 1 мл аликвоту 100X антибиотикам (пенициллин плюс стрептомицин)
- И 0,5 мл аликвоту L-глютамин
- После решения имеют оттаяли, взял их из водяной бани, распылить их вниз с 70% этанола, и поместите их в капот. Теперь покрытие и Neurobasal среды может быть подготовлен.
- После решения готовятся, крышка емкости плотно и поместите их в 37 ° С ванну, чтобы разогреть при выполнении гиппокампа изоляции.
- Кроме того, возьмите аликвоту протеазы трипсина (2,5%) из морозильника и поместить его в водяной бане. Трипсин переваривает расчлененный гиппокампе, которые будут выделены в следующем шаге.
- Возьмите 15 мл коническую трубку, наполнить его HBSS и пометьте его с лечебной группе. Именно здесь изолированных гиппокампе будут собираться в следующий шаг.
Гиппокампа Изоляция
- Для начала гиппокампа изоляции, убедитесь, что новорожденные щенки были чистыми и имели их молоко полосы, плаценты и пуповины удалены их мать.
- Место щенков в чашке Петри, спрей с 70% этилового спирта для очистки, и поместите их в капот. Животных усыпляют непосредственно перед культивирования.
- Для дальнейшей стерилизации взять один щенок от блюда, окуните щенка в 70% этанола, а затем на два моет стерильного HBSS.
- Удалите головы от тела с помощью ножниц. Используя те же ножницы, разрезать кожу и череп.
- Используя пару тонких пинцет, очистить череп от мозгов и место мозг в небольшой чашке Петри, содержащей небольшое количество стерильного HBSS.
- Пил назад полушарий головного мозга. Гиппокамп является небольшим, морские коньки-образной структуры в медиальной височной доле.
- Удалить гиппокампе и поместить в 3 мл HBSS в 15 мл трубки. Повторите эти действия с каждым щенком, и место каждой изолированной гиппокампа в 15 мл трубки. Теперь, пришло время отделить ткани отдельных клеток.
Гиппокампа клеточной диссоциации
- В конце концов гиппокампе были изолированы, заполнить 15 мл трубки до 4,5 мл HBSS.
- Удалить трипсина из водяной бани, спрей с этанолом, и место в капюшон. Добавить 0,5 мл трипсина в трубке, и инкубировать в течение 15 минут при температуре 37 ° C.
- В капот, удалять HBSS / трипсина раствор из трубки с стерильную пипетку, стараясь не мешать гиппокампе, которые осели на дне пробирки. Добавьте 5 мл HBSS к трубке и водоворот мягко. Инкубировать при 37 ° С в течение 5 минут.
- Повторите этот шаг в два раза, удаляя старые HBSS и заменить свежим раствором.
- Возьмите аликвоту ДНКазы я из холодильника. Добавить 0,5 мл ДНКазы в гиппокампе в 4,5 HBSS мл. ДНКазы добавляется способствовать инактивации фермента.
- Растирают раствор (или пипетки вверх и вниз), пока не будет однородной. Будьте осторожны, чтобы не вводить пузырей в гомогената.
- Определение жизнеспособности клеток за исключением метода трипанового синий.
- Возьмите 10 см чашку Петри, содержащей 6 до 8 покровные, и добавить 10 мл покрытие среды. Внести необходимое количество клеток на блюдо с покровные. Swirl мягко расходиться клеток, и убедитесь, что покровные не перекрываются.
- Разрешить клетки приложить на 2-4 часа в увлажненные 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2. После подтверждения, что клетки жизнеспособны и приложил, передача покровные отдельных блюд, содержащих Neurobasal среды. Место этих блюд обратно в инкубатор.
- Один раз в неделю, заменить одну треть среды со свежими Neurobasal средних и экспериментальных методов лечения, по мере необходимости. Теперь, функциональные свойства этих клеток в культуре готовы изучить.
Фура-2 Кальций изображений нейронов гиппокампа
- После культурной нейроны гиппокампа были в пробирке в течение 48 часов (но не раньше), эксперименты кальция изображений может начаться. На данный момент, эти нейроны должны начали распространяться процессов. Оптимальный диапазон возраста кальция визуализации изо дня в пробирке 3 до 7.
- Нагрузка культур с Фура-2 утра в течение 30 минут при температуре 37 ° С, после чего они могут быть отображены в 20х цель использованием ксеноновой дуговой лампы для возбуждения красителя кальция индикатор и 512 бит ПЗС-камера, которая образцы каждые 150 мс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол был разработан как модификация оригинальной работе Гэри Банкир и Ким Гослин 1. Эта книга является важнейшим ресурсом для всех, кто интересуется культивирования клеток - не только нейрон обогащенного культур описаны в текущем протоколе.
Три наиболее важных факторов культивирования клеток являются: бесплодие, скорость, выбор используемой среды.
Стерильность - ламинарный поток / стерильной капот, асептических условиях, и стерильные инкубатор обязательны для заполнения. Загрязнение на любом этапе наносит ущерб не только к текущему эксперимент над которым вы работаете, но и последующей работы, которые могут быть запланированы. После инкубатор загрязняется, это может занять несколько недель (или месяцев), чтобы получить его очищают и стерильными. Загрязнение, хотя и не сразу видно, на видимом уровне, безусловно, влияют на жизнеспособность клеток и физиологии. Бесплодие является обязательным условием.
Скорость - здоровье культивируемых клеток сильно привязаны к времени клетки не в атмосфере и среднего контролируемой среде. Поэтому очень важно, чтобы количество времени, необходимое для удаления из клетки животного, пока клетки находятся в покрытие среды на минимальном уровне. Потому что многочисленные шаги не могут быть изменены (время в вынашиваются в трипсина или мыли), что может быть изменено это количество времени, необходимое для удаления клеток из мозга. Практика вскрытия часто. Количество времени, необходимое для этого шага должна быть воспроизводимой.
Выбор среды - Есть множество собственных средах, одна из которых является Neurobasal. До дней использования Neurobasal, глиальных кондиционированной среды (которые нужно было сделать по-отдельности - это обсуждается в книге банкира и Гослин 1) не требуется. Несмотря на это, важно, что вы знаете, что есть в среде, которая используется. Наряду с Neurobasal, дополнения, такие как B-27 часто используется. Убедитесь, что составляющие этих средних и добавки, как известно, так как они могут повлиять на свойства клеток. Это стандартная практика в моей лаборатории использовать сыворотки / уголь лишили / фенола красного среде без избегать стероидных гормонов (учитывая, что большая часть работ, выполненных в моей лаборатории расследует действия стероидных гормонов). Эта концепция - знают, что в решения, которые вы используете - имеет решающее значение для всех этапов культивирования клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JLN была поддержана MH 68347.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
