Summary
La disección y el crecimiento de las células de un área del cerebro individuales facilita la investigación de los parámetros celulares y fisiológicos. Se describe un método para el cultivo de células primarias que produce neuronas enriquecido las culturas en un ambiente libre de suero.
Abstract
Las propiedades fisiológicas de las neuronas del hipocampo son comúnmente investigados, sobre todo debido a la participación del hipocampo en la memoria y el aprendizaje. Cultivo de células primarias del hipocampo permite neurocientíficos para examinar la actividad y las propiedades de las neuronas en la celda individual y el nivel de sinapsis individuales. En este video, vamos a demostrar cómo aislar y cultivar células primarias del hipocampo de ratas recién nacidas. El hipocampo puede ser aislado de cada animal recién nacido en tan corto como 2 a 3 minutos, y los cultivos se pueden mantener hasta por dos semanas. También vamos a demostrar brevemente cómo utilizar estas neuronas del hipocampo de imágenes de calcio radiométrica. Aunque este protocolo describe el proceso para el hipocampo, con poca o ninguna modificación, se puede aplicar a otras regiones del cerebro.
Protocol
Antes del aislamiento del hipocampo
Antes de comenzar el aislamiento del hipocampo, asegúrese de que todas las herramientas que son estériles. Aerosol por la campana de la cultura con el 70% de etanol, y el lugar de las herramientas dentro de la campana. Usted tendrá 6 - y 10 cm de placas de Petri estériles de poli-L cubreobjetos de vidrio recubierto, pipetas y puntas, pipetas desechables, y una pipeta de electricidad. A partir de ahora, no olvides utilizar una técnica estéril correcta.
- A su vez en el baño de agua y asegurarse de que se calienta a 37 ° C.
- Las siguientes soluciones que se almacenan a 4 º C será necesario:
- Medio modificado de Eagle (MEM)
- Neurobasal
- Solución salina tamponada de Hank (HBSS)
- Borato de solución tampón
- Piruvato sódico
- Esterilizada por filtración de glucosa en solución al 20% en agua destilada
- Asegúrese de que la fumigación de todas las botellas hacia abajo con etanol al 70% antes de colocarlos en el capó.
- Tome estas soluciones congeladas del congelador y colóquelos en un baño de agua caliente:
- Una alícuota de 5 ml de suero de caballo
- A 1 ml de alícuota de B-27 suplemento
- A 1 ml de alícuota de 100 veces con antibióticos (penicilina y estreptomicina)
- Y una alícuota de 0,5 ml de L-glutamina
- Después de las soluciones se han descongelado, los saca del baño de agua, aerosol hacia abajo con etanol al 70%, y colocarlos en la campana. Ahora el medio de planchas y Neurobasal se puede preparar.
- Después de las soluciones se preparan, tapa de los recipientes bien y ponerlos en la 37 ° C baño para calentar mientras se realiza el aislamiento del hipocampo.
- Además, tomar una alícuota de la proteasa tripsina (2,5%) del congelador y colocarlo en el baño de agua. Tripsina se digieren en el hipocampo disecado, que se aisló en el siguiente paso.
- Tome un tubo cónico de 15 ml, llenar con HBSS, y la etiqueta con el grupo de tratamiento. Es aquí donde aisladas hipocampo se recogerán en el próximo paso.
Aislamiento del hipocampo
- Para comenzar el aislamiento del hipocampo, asegúrese de que los cachorros recién nacidos son limpios y que sus bandas de leche, placentas y cordones umbilicales retirado por su madre.
- Lugar a los cachorros en una placa Petri, rocíe con el 70% de etanol para limpiar y colóquelos en la campana. Los animales son sacrificados inmediatamente antes de cultivar.
- Para la esterilización de más tener un cachorro de la antena, introduzca el perrito en etanol al 70%, y luego en dos lavados de HBSS estéril.
- Quite la cabeza del cuerpo con unas tijeras. Utilizando la misma tijera, cortar la piel y el cráneo.
- Con un par de pinzas finas, pelar la cabeza fuera del cerebro y el lugar del cerebro en una pequeña placa de Petri que contiene una pequeña cantidad de HBSS estéril.
- Pele los hemisferios cerebrales. El hipocampo es un pequeño caballito de mar en forma de estructura en el lóbulo temporal medial.
- Quitar el hipocampo y el lugar en 3 ml de HBSS en un tubo de 15 ml. Repita estos pasos con cada cachorro, y el lugar de cada hipocampo aislado en el tubo de 15 ml. Ahora, es hora de disociar el tejido de las células individuales.
Hipocampo disociación celular
- Después de todo hipocampo han sido aislados, llenar el tubo de 15 ml a 4,5 ml con HBSS.
- Retire la tripsina del baño de agua, rociar con etanol, y el lugar en el capó. Añadir 0,5 ml de tripsina en el tubo, y se incuba durante 15 minutos a 37 ° C.
- En la capilla, se retira la solución HBSS / tripsina del tubo con una pipeta estéril, teniendo cuidado de no molestar a los hipocampos que han depositado en el fondo del tubo. Añadir 5 ml de HBSS en el tubo y agitar. Se incuba a 37 ° C durante 5 minutos.
- Repita este paso dos veces, la eliminación de la HBSS viejo y reemplazarlo con solución nueva.
- Tomar una alícuota de DNasa I del congelador. Añadir 0,5 ml de DNasa para los hipocampos en 4,5 ml HBSS. La DNAsa se añade a promover la inactivación de la enzima.
- Triturar la solución (o una pipeta de arriba a abajo) hasta que esté homogéneo. Tenga cuidado de no introducir burbujas en el homogeneizado.
- Determinar la viabilidad celular con el método de exclusión con azul de tripano.
- Tome una cápsula de Petri de 10 cm que contiene 6-8 cubreobjetos, y se añaden 10 ml de medio de recubrimiento. Pipeta el número deseado de células de la cápsula que contiene el cubreobjetos. Hágalo girar suavemente para dispersar las células, y asegúrese de que el cubreobjetos no se superpongan.
- Permiten a las células para conectar de 2-4 horas en un humidificado incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2. Después de confirmar que las células son viables y se ha fijado, la transferencia de los cubreobjetos de platos que contienen medio Neurobasal. Colocar los platos de nuevo en la incubadora.
- Una vez a la semana, cambie un tercio de la media con un nuevo medio Neurobasal y tratamientos experimentales, según sea necesario. Ahora, las propiedades funcionales de estas células en cultivo están listos para ser estudiados.
Fura-2 Calcio imágenes de las neuronas del hipocampo
- Después de las neuronas del hipocampo cultivadas han sido in vitro durante 48 horas (pero no antes), los experimentos de imagen de calcio puede comenzar. En este punto, estas neuronas se han comenzado a ampliar los procesos. El rango de edad óptima para imágenes de calcio es a partir del día in vitro 3 a 7.
- Culturas de carga con Fura-2 AM para 30 minutos a 37 ° C, después de lo cual se pueden visualizar en un objetivo de 20X con una lámpara de arco de xenón para excitar el tinte indicador de calcio y de 512 bits cámara CCD, que se toman muestras cada 150 ms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo fue desarrollado como una modificación de los trabajos seminales de Gary Banker y Kim Goslin 1. Este libro es un recurso esencial para cualquier persona interesada en el cultivo de células - no sólo los cultivos de neuronas enriquecido se describe en el protocolo actual.
Los tres factores más importantes en el cultivo de la célula son: la esterilidad, la velocidad, la elección del medio utilizado.
Esterilidad - un flujo laminar / campana estéril, las condiciones de asepsia, y una incubadora de estériles son obligatorios. La contaminación en cualquiera de los pasos es perjudicial no sólo para el actual experimento que está trabajando, sino también el trabajo posterior que se han planificado. Después de una incubadora se contamina, puede tomar semanas (o meses) para limpiarla y estéril. La contaminación, aunque no evidente de inmediato a un nivel visible, sin duda afectará a la viabilidad celular y la fisiología celular. La esterilidad es un imperativo.
Velocidad - la salud de las células en cultivo está fuertemente ligado a la cantidad de tiempo que las células no están en un ambiente y medio ambiente. Por lo tanto, es esencial que la cantidad de tiempo necesario para eliminar las células de los animales hasta que las células se encuentran en el medio de recubrimiento está en un mínimo. Debido a que muchas medidas no pueden ser alterados (tiempo de incubación de la tripsina o lavado de ser), lo que se puede modificar es la cantidad de tiempo necesario para eliminar las células del cerebro. La práctica de la disección a menudo. La cantidad de tiempo necesario para que este paso tiene que ser reproducibles.
Elección del medio - hay numerosos medios de propiedad, uno de los cuales se Neurobasal. Antes de los días de la utilización de medio Neurobasal, gliales acondicionado (que debía hacerse por separado - esto se discute en el libro de Banker y Goslin 1) era necesario. No obstante, es importante que usted sepa lo que está en el medio que se está utilizando. Junto con Neurobasal, un suplemento como el B-27 se utiliza a menudo. Asegúrese de que los componentes de estos medios y los suplementos son conocidos, ya que puede afectar las propiedades de las células. Es una práctica habitual en mi laboratorio para el uso libre de suero / carbón despojado / fenol medio libre de rojo para evitar que las hormonas esteroides (dado que una gran parte de los trabajos realizados en mi laboratorio investiga las acciones de las hormonas esteroides). Este concepto - saber lo que está en las soluciones que está utilizando - es fundamental para todas las etapas de cultivo de células.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
JLN fue apoyada por MH 68347.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
