Summary
هذا الفيديو يصف التلاعب في الخلايا العصبية مثقف باستخدام الليزر ملاقط في المختبر.
Abstract
في هذه الورقة ، والفيديو ، ونحن تصف البروتوكولات المستخدمة في المختبر لدينا لدراسة تفضيلات استهداف عمليات تجديد الخلايا من الخلايا العصبية للشبكية الكبار في المختبر. إجراءات لإعداد الثقافات خلايا شبكية تبدأ عملية الهضم ، وتشريح سحن من شبكية العين ، وتنتهي مع طلاء للخلايا الشبكية معزولة على أطباق مصنوعة خصيصا للاستخدام مع ملاقط الليزر. وتنقسم هذه الأطباق في خلية half اللاصقة والمواد الطاردة للنصف الخلية. وهي مغلفة الجانب اللاصق الخلية بطبقة من الأضداد - 1 سال ، والتي توفر الركيزة التي تقوم عليها خلايانا النمو. ويمكن استخدام لاصق ركائز أخرى لأنواع الخلايا الأخرى. وهي مغلفة الجانب طارد الخلية بطبقة رقيقة من البولي HEMA. محاصرون الخلايا مطلي على الجانب بولي HEMA للطبق مع ملاقط الليزر ونقلها ثم وضعت في زنزانة مجاورة على الجانب - 1 سال لخلق الزوج. وينبغي تشكيل مجموعات من أي حجم الخلية يكون ممكنا مع هذه التقنية. "الليزر ملاقط المجهرية التي تسيطر عليها" يعني أن المحقق يمكن اختيار أي خلايا للتحرك ، والمسافة المطلوبة بين الخلايا يمكن أن تكون موحدة. لأن شعاع الليزر يمر عبر سطوح شفافة من صحن والثقافة ، وتتم تحديد الخلية والتنسيب في بيئة مغلقة معقمة. يمكن رصد الخلايا الفيديو مرور الزمن وتستخدم مع أي تقنية بيولوجية الخلية المطلوبة. هذه التقنية قد تساعد التحقيق في خلية خلية التفاعلات.
Protocol
ملاقط بصرية لمعالجة الخلايا المعزولة في الثقافة
تتولد من محاصرة القوات ملاقط بصرية من الزخم للضوء (Ashkin ، 1991 ؛. Ashkin وآخرون ، 1986). على الرغم من أن هذه القوات الفخ بسهولة الخلايا في التعليق ، فهي ليست قادرة على نقل الخلايا التي تلتزم السطح. لذلك ، للحد من الالتصاق على طبق الثقافة في النقطة التي يتم فيها محاصرة الخلايا ، ساترة المغلفة مع البولي - 2 - hydroxyethylmethacrylate (بولي هيما) (سيغما كيميكال ، وسانت لويس ، MO) مركب ، غير سامة مع الخلية طارد الخصائص المستخدمة سابقا للدراسات على التصاق الخلايا البطانية (فوكمان وموسكونا ، 1978). بينما بولي HEMA يغطي نصف الطبق الثقافة ، وهي مغلفة والنصف الآخر مع الركيزة التي تدعم نمو الخلايا. في المختبر لدينا ، يتم استخدام سال (1) بوصفها الركيزة للخلايا السمندل زراعة الشبكية. الإجراء لافتعال سال (1) ويوصف بولي HEMA الأطباق المغلفة أدناه :
تصنيع الأطباق الثقافة
- coverglasses نظيفة (# 1 VWR العلمية المحدودة ، وسائل الإعلام ، والسلطة الفلسطينية) في حامض. وقد تم اختيار هذا ساترة لسمك لها ل0.1mm للتو ، ضرورية لأهداف الفتحة العددية العالية المطلوبة لتركيز الليزر.
- لإنشاء منطقة طارد الخلية ، ويحل 20 ملغ بولي هيما (سيغما كيميكال ، وسانت لويس ، MO) في 1ml من الايثانول 95 ٪ بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. يفضل ، ينبغي استخدام هذا الحل في حدود 1 في الشهر من التحضير.
- دعم لموقف coverglasses في رأسي قرب في بيئة خالية من الغبار مثل غطاء محرك السيارة.
- مكان واحد أو قطرتين من محلول بولي HEMA قرب أعلى ساترة من غيض من البلاستيك micropipette 200μl. ينبغي أن يقتصر قطرات (حوالى 50 100μl لكل منهما) لنصف ساترة. المنحدر الحاد يضمن السائل يتدفق على سطح ساترة إلى أسفل ، وتوفير طلاء رقيقة حتى بولي HEMA. السماح للcoverglasses بولي HEMA المغلفة ليجف في غطاء محرك السيارة عن 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- علامة الجانب بولي HEMA من ساترة بالقلم غيض غرامة على مقربة من الحافة.
- حفر ثقب 1 سم في الجزء السفلي من صحن الثقافة 35 مم.
- ساترة الغراء بولي HEMA المغلفة لقاع الطبق الثقافة مع Sylgard 184 (داو كورننغ شركة ميدلاند ، ميتشيغن) بحيث الجانب بولي HEMA المغلفة يواجه نحو الداخل من صحن. ضمان حافة طلاء بولي HEMA يمتد الى اسفل وسط حفرة. السماح للأطباق لتجف لمدة 1-3 أيام في درجة حرارة الغرفة في بيئة خالية من الغبار.
- خط الصفر على السطح الخارجي للساترة بالقلم الماس الحافة التالية حافة طلاء بولي HEMA. ثم ، لا شيء خطين العبور في زوايا الحق في ذلك حوالي 2mm وعدا. نقطتي تقاطع بمثابة مرجع أو نقاط إيمانية ليتم استخدامها لاستنساخ نفس اتجاه الطبق الثقافة على المسرح المجهر.
- تعقيم الأطباق تحت الضوء فوق البنفسجي بين عشية وضحاها.
- لإنشاء خلية نصف ملتصق من صحن والثقافة ، ومعطف غير بولي HEMA نصف مع سال - 1 ، الذي يحتوي على الماوس المضادة للأجسام المضادة التي أثيرت ضد السمندل أغشية الخلايا الشبكية (المقدمة بسخاء من قبل الدكتور بيتر MacLeish ، مورهاوس في كلية الطب واتلانتا ، جورجيا ، وانظر MacLeish وآخرون (1983)). أولا ، معطف - 1 سال جنب مع ما يقرب من 0.1 100μl ملغ / مل العقيمة الماعز المضادة للماوس مفتش الأضداد (مانهايم بورنغير كوربوريشن ، في انديانابوليس) ، مع الحرص على عدم تسرب السائل أكثر على الجانب بولي HEMA. إجازة لمدة ثلاث ساعات ، ثم إزالته. غسل نفس المنطقة مع حل رينغر العقيمة مرة واحدة أو مرتين ، ثم ضع 100μl سال طاف - 1 ، مع الحرص على عدم تسرب السائل الى الجانب بولي HEMA للطبق. على الضد first يضمن المغلفة سال - 1 عند تركيز معروفة.
- احتضان الأطباق مع ليلة وضحاها سال - 1.
- إزالة الحل سال - 1 الأضداد وشطف المنطقة مع حل رينغر العقيمة ل. 2 مل أعرض المتوسطة إلى الطبق قبيل الطلاء الخلية.
تم العثور على تكوين الحل رينغر البرمائيات ، وخالية من مصل المتوسطة البرمائيات ، والحل رينغر للهضم أنزيم في MacLeish تاونز وأندرسون (1988) وآخرون مانديل. (1993).
إعداد الثقافات الخلية
وقد استمدت هذه الخلايا المستخدمة في هذا الفيديو من الضوء مكيفة ، والكبار والمائية المرحلة نمر السلمندر (Ambystoma tigrinum) ، وقياس 17-22 سم في الطول (تشارلز سوليفان ، وشركة ناشفيل بولاية تينيسي) ، حافظ على 5 درجات مئوية على ح 12 : 12 ساعة للضوء الظلام دورة. وتمت الموافقة على البروتوكولات التي المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (IACUC) في جامعة الطب وطب الأسنان في نيوجيرسي ، وفقا للمبادئ التوجيهية الصارمة من المعاهد الوطنية للصحة. ووصف إجراءات لإعداد الثقافات خلايا شبكية بواسطة نحمان - Clewner تاونز واندرسون (1996) و هي كما يلي :
- قطع رأس وباب الحيوانات. إزالة العيون وتشريح خارج القرنيات وقزحية العين. ينبغي للفصل شبكية العين قليلا داخل فنجان العين. عن طريق وضع ملقط المنحني تحت شبكية العين ، مغرفة خارج شبكية العين. ليس من المهم إذا تم إرفاق العدسة إلى الشبكية في هذه المرحلة.
- هضم في شبكية العين غراء يو / مل 14 (رثينجتون ، التملك الحر ، ونيو جيرسي) في حل السمندل رينغر لمدة 40 دقيقة.
- قبل استخدامها ، ينبغي فقاعات الحل رينغر غراء مع O 95 ٪ 05/02 ٪ أكسيد الكربون غاز 2 لمدة 30 دقائق. ، ثم تعقيمها قبل المرور عبر فلتر ميكرون 0.22 (ميليبور ، Carrigtwohill ، ايرلندا).
- شطف شبكية العين بمحلول معقم السمندل رينغر ثلاث مرات.
- إزالة العدسات من الحل رينغر ، ثم يسحن بلطف الأنسجة الشبكية مع 3 ملم تحمل ماصة لتسفر عن التعليق الخلية.
ملاقط ليزر التلاعب من الخلايا العصبية معزولة
- مكان الطبق الثقافة على المسرح المجهر ، وتوجيه الطبق عن طريق مواءمة علامة على الطبق مع نقطة مرجعية على الساحة. حفظ إحداثيات نقاط إيمانية في الكمبيوتر.
- لوحة الخلايا على حد سواء سال (1) وبولي HEMA نصفي للطبق.
- تسمح هذه الخلايا إلى تسوية لحوالي 20 دقيقة ، وهي مدة كافية لخلايا على الجانب ملتصق من صحن لإرفاق الركيزة الأضداد.
- حدد خلية على الجانب سال - 1 ملتصقة للطبق. علامة x و y المرحلة إحداثيات موقف قريب من الخلية. في حالتنا ، فإن النقطة 10μm تقريبا من التشعبات الأساسي للخلية المحددة. حفظ الإحداثيات في جهاز الكمبيوتر.
- تحديد الخلايا العصبية الثانية ، في حال رئيسنا على مستقبلة للضوء ، وعلى الجانب بولي HEMA من صحن واستخدام أداة الليزر لاعتراض منتاش عليه. لا يمكن أن يتحقق محاصرة أكثر من مجموعة واسعة من مستويات السلطة. ومع ذلك ، وضعنا قوة الليزر على 10 ٪ -20 ٪ ، وهي نسبة منخفضة بما فيه الكفاية لتجنب الحطام محاصرة مع الخلية ، ولكنها كافية لنقل الخلية من خلال وسيط.
- في حين عقد الخلية في الفخ ، وانخفاض في مرحلة الخلية بحيث أصبح أعلى بكثير من سطح الطبق والثقافة ، وفوق أي الخلايا العصبية المرفقة. التحرك في المرحلة تحت سيطرة الكمبيوتر لجعل الخلية إلى س حفظها سابقا ، وينسق ذ على الجانب - 1 سال. تم تعيين حركة المسرح في ليالي / 8 20μm ، ولكن ينبغي أن تحدد السرعة القصوى تجريبيا. عند وصوله إلى الوجهة نقطة على الجانب سال - 1 ، ورفع هذه المرحلة لتحقيق الخلية المحاصرين على سطح الطبق. ويمكن إجراء التنسيب الخلية مع دقة من بضعة ميكرونات. السماح للخلية التمسك الركيزة - 1 سال.
- الحصول على الصور الرقمية على حد سواء من الخلايا في الزوج قبل وبعد تشكيل الزوج يوفر سجلا مفيدة.
- الحفاظ على أزواج خلية في حاضنة. لخلايا السمندل ، ضع الأطباق في غرفة ترطيب في 10 درجة مئوية. يمكن رصد الخلايا الفاصل الزمني الفيديو واستخدامها مع أي تقنية بيولوجية الخلية المطلوبة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الضوء والزخم ، وعندما شعاع الضوء ينكسر عند مروره من خلال خلية ، لا بد من القوة لتغيير اتجاه الزخم. بسبب قانون الحفاظ على الزخم ، يجب أن يشكل قوة في الاتجاه المعاكس ، في المقابل ، رد فعل مرة أخرى على الخلية. وأظهرت Ashkin (1991) أن القوة التي تم إنشاؤها بواسطة أشعة الليزر التي تركز عدسة المجهر الهدف ستتحرك خلية نحو وسط التركيز. على الرغم من شعاع الليزر يولد سوى عدد قليل من piconewtons القوة ، هذه القوة غير كافية لسحب خلية من خلال المتوسط. ويستخدم طول موجة الأشعة تحت الحمراء القريبة التي تمتص المياه سيئة من قبل لتفادي الأضرار التي لحقت الخلية (ليو وآخرون 1995). محطة العمل منتاش الليزر المستخدمة في المختبر لدينا (خلية الروبوتات ، وشركة ألبوكيركي شمال البحر الأبيض المتوسط) يستخدم 1 واط ، الصمام الثنائي ليزر الموجة المستمرة من الطول الموجي 980nm. تبث ضوء الليزر إلى الخلايا عن طريق الغمر النفط 40X عدسة خطة neofluor الهدف من الفتحة العددية عالية (NA1.3) (كارل زايس شركة) والتي تركز شعاع في الطائرة التنسيق نفس المجهر.
ملاقط الليزر التي تسيطر عليها المجهرية يقدم عددا من المزايا على دراسات على الخلايا مطلي بشكل عشوائي. على سبيل المثال ، يمكن وضع الخلايا في المسافة المطلوبة عن بعضها البعض والتي يمكن أن تكون موحدة لجميع خلايا التلاعب بها. بالإضافة إلى ذلك ، شعاع الليزر يمر عبر السطح الشفاف للطبق الثقافة ، وبالتالي يتم التلاعب خلية في بيئة مغلقة معقمة. قوات صغيرة جدا التي تم إنشاؤها بواسطة الليزر يضع حد على ما يمكن المحاصرين. في تجربتنا ، وشكل خلية التصاق هي أهم العوامل التي تحد من محاصرة ناجحة. بشكل عام ، ونحن فخ خلايا منعزلة من 15μm - 10 في قطر ونقلها مسافات عدة ملليمترات عبر صحن الثقافة إلى وجهتهم. فمن الممكن للتحرك أكبر من هذه الخلايا ، مثل الخلايا الدبقية مولر ، والتي هي 20 في طول و40μm هي أكبر الخلايا في ثقافاتنا.
بسبب محاصرة الخلايا هي الخلايا التحدي عندما تلتزم أسفل الزجاج من صحن والثقافة ، وإلى بعضهم البعض ، ووضع على سطح الخلية طارد على ساترة به بولي HEMA ثبت لا تقدر بثمن لنجاحنا في معالجة الخلايا. وحتى مع ذلك ، فإن الخلايا على سطح بولي HEMA أدبق أصبحت في نهاية المطاف وكان من الصعب التلاعب في الثقافات أكثر من 1-2 ساعات من العمر. كبار السن في الثقافات ، وممارسة شائعة في مختبرنا هو محاولة لالتقاط الخلايا مع ليزر باستخدام الإعداد الطاقة القصوى ، ثم تتحول السلطة وصولا الى نقلها.
السهولة التي يمكن أن تكون الأشياء الصغيرة المحاصرين في الليزر يعني أنه يمكن سحب الحطام في فخ من مسافات جيدا خارج الخلية. تبين أن هذا الأمر مشكلة أثناء محاصرة من خلايانا. ويمكن تجنب ذلك في معظم الحالات من خلال رفض السلطة من الليزر إلى أدنى حد ممكن التي يمكن أن تعقد داخل الخلية في الفخ. يقتصر على السرعة التي يمكن أن تنقل الخلايا في فخ من اللزوجة في المتوسط. وضعناها عادة سرعة في حوالي 8-20 ميكرون / الثانية التي عثر عليها لتكون ضمن مجموعة وآمنة للنقل.
ويجب النظر في إمكانية أن الليزر له آثار ضارة على الخلايا التي عقدت في الفخ. في ثقافاتنا الشبكية ، فإننا نواجه كائنات الظلام مثل الخلايا الصبغية التي دمرت عندما استولت عليها في شعاع الليزر. بوضوح ، وبالتالي ، لا يمكن أن تدرس هذه الخلايا باستخدام الليزر ملاقط. ولكن في الدراسات السابقة على الخلايا العصبية للشبكية ومبصرات التي أجريت في المختبر لدينا ، وجدنا أي اختلاف في النمو لالتهاب الأعصاب والقدرة على الربط بين شكل الخلايا منتاش الذي يتلاعب به والخلايا غير التلاعب (تاونز اندرسون وآخرون 1998 ؛ كلارك وآخرون 2008 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
كان مدعوما من قبل المنح البحثية والمعاهد الوطنية للصحة EY012031 EY0182175 ومؤسسة كيربي FM.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR international | 48380 080 | |
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning | 7078A-5 | |
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc. | ||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss, Inc. | Numerical aperture (N.A. 1.3) | |
| Black and white CCD camera | Sony Corporation | ||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
