Summary
Bu video in vitro lazer cımbız kullanarak manipülasyon kültürlü nöronların açıklamaktadır.
Abstract
Bu kağıt ve video, hedefleme tercihleri, in vitro yetişkin retinal nöronların yenileyici hücre süreçlerini incelemek için laboratuarda kullanılan protokoller açıklanmaktadır. Kaplama ile izole retina hücrelerinin özellikle lazer cımbız ile kullanımı için yapılan yemekler diseksiyonu, sindirim ve retina, öğütme ve bitiş retinal hücre kültürlerinin hazırlanması için prosedürler ile başlar. Bu yemekleri bir hücre yapışkan yarım ve bir hücre itici yarısı ayrılır. Hücre yapıştırıcı yan hücrelerin büyümesine üzerine bir substrat sağlarlar Sal-1 antikorları, bir tabaka ile kaplanmıştır. Diğer yapışkan substratlar diğer hücre türleri için kullanılabilir. Hücre itici tarafı poli-HEMA ince bir tabaka ile kaplıdır. Yemeğin poli-HEMA tarafında kaplama hücreleri, lazer cımbız ile tuzağa taşınan ve ardından bir çift oluşturmak için bir hücre Sal-1 tarafta komşu olarak yerleştirilmelidir. Bu teknik ile herhangi bir boyut hücre gruplarının oluşumu mümkün olmalıdır. "Lazer cımbız kontrollü mikromanipülasyon" araştırmacı hücreleri taşımak için hangi seçim anlamına gelir, ve hücreler arasındaki istenen mesafe standart olabilir. Çünkü lazer ışını kültür çanağı şeffaf yüzeylerden geçer, hücre seçme ve yerleştirme, kapalı, steril bir ortamda yapılır. Hücreler video time-lapse tarafından izlenmekte ve gerekli her türlü hücre biyolojik tekniği ile kullanılabilir. Bu teknik, hücre-hücre etkileşimleri soruşturma yardımcı olabilir.
Protocol
Izole kültür hücreleri işlemek için Optik cımbız
Optik cımbız Yakalama güçleri ışık ivme (Ashkin ve ark, 1986 Ashkin, 1991) oluşturulur. Bu güçlerin kolayca süspansiyon hücreleri tuzak olsa da, onlar bir yüzeye bağlı hücreleri hareket etmek mümkün değildir. Bu nedenle, hücrelerin tuzağa noktada kültür çanak yapışma azaltmak için, lamel itici hücre ile poli-2-hydroxyethylmethacrylate (poli-HEMA) (Sigma Chemical Co, St Louis, MO), toksik olmayan bileşik kaplı özellikleri daha önce endotel hücreleri (Folkman ve Moscona, 1978) yapışma çalışmaları için çalışmaktadır. Poli-HEMA bir kültür yemeğin yarısını kapsar, diğer yarısı hücre büyümesini destekleyen bir substrat ile kaplanmıştır. Laboratuvarımızda, Sal-1, kültür semender retina hücreleri için substrat olarak kullanılır . Sal-1 imalatı ve poli-HEMA kaplı yemekleri aşağıda açıklanan prosedürü:
Kültür yemekleri imalatı
- Temizlik coverglasses asit (# 1 VWR Bilimsel A.Ş., Medya, PA). Bu coverglass lazer odaklanma için gerekli yüksek sayısal açıklık hedefleri için gerekli olan sadece 0.1mm kalınlığı için seçildi.
- Bir hücre itici alanı oluşturmak için, oda sıcaklığında bir gecede% 95 etanol 1 ml 20 mg poli-HEMA (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) çözülür. Tercihen, bu çözüm hazırlık 1 ay içinde kullanılması gerekir.
- Yakın dikey konumda bir başlık gibi tozsuz bir ortamda coverglasses Prop.
- 200μl mikropipet plastik ucundan coverglass en yakın poli-HEMA çözümün bir veya iki damla yerleştirin. Damla (her 50-100μl hakkında) coverglass bir yarısında sınırlı olmalıdır. Eğimli sıvı ince bir poli-HEMA bile kaplama, alt coverglass yüzeyi aşağı akar sağlar. Poli-HEMA kaplı coverglasses kaput oda sıcaklığında 30-60 dakika kurumasını bekleyin.
- Coverglass poli-HEMA yan kenarına yakın bir ince uçlu kalem ile işaretleyin.
- 35 mm kültür çanak alt kısmında 1 cm delik.
- Tutkal, poli-HEMA kaplı yan yemeğin içine dönüktür Sylgard 184 (Dow Corning Co, Midland) ile kültür çanak alt poli-HEMA kaplı coverglass. Poli-HEMA kaplama kenar olun deliğin merkezi çalışır. Yemekleri, tozsuz bir ortamda oda sıcaklığında 1-3 gün boyunca kurumasını bekleyin.
- Poli-HEMA kaplama kenarında bir elmas uçlu kalem ile coverglass dışında bir çizgi kazıyıp. Ardından dışında yaklaşık 2mm dik açıda iki geçiş çizgileri çizebilir. Iki kesişme noktası, referans mikroskop sahnede kültür çanağı aynı yönde yeniden kullanılmak üzere fiducial noktaları olarak hizmet vermektedir.
- Bulaşıkları gecede ultraviyole ışık altında sterilize edin.
- , Retinal hücre zarlarının (cömertçe Dr. Peter MacLeish Morehouse School of Medicine tarafından sağlanan karşı yükseltilmiş bir fare anti-semender antikor içeren bir hücre kültürü çanak-yapışık yarısı olmayan Sal-1 ile poli-HEMA yarım kat, oluşturmak için Atlanta, GA. MacLeish ve ark (1983) bakınız). İlk olarak, ceket, yaklaşık 100μl 0.1 mg / ml steril keçi anti-fare IgG (Corporation'ın Boehringer Mannheim, Indianapolis IN) Sal-1 tarafı, poli-HEMA yüzüne üzerine sıvı dökmemeye özen. Üç saat bekletin, sonra çıkarın. Bir veya iki kez, daha sonra çanağı poli-HEMA yan içine sıvı dökmemeye özen 100μl Sal-1 süpernatant yerde aynı alanda steril Ringer solüsyonu ile yıkayınız. Sal-1, bilinen bir konsantrasyonda kaplı ilk antikor sağlar.
- Sal-1 gecede yemekler inkübe edin.
- Sal-1 antikoru çözüm çıkarın ve steril Ringer solüsyonu ile bölgeyi durulayınız. Hücre kaplama hemen önce yemek için 2 ml orta tanıtın.
Amfibi Ringer solüsyonu, serum serbest amfibi, orta ve enzim sindirim için Ringer solüsyonu kompozisyon MacLeish ve Townes-Anderson (1988) ve Mandell ve ark. (1993).
Hücre kültürlerinin hazırlanması
Bu video kullanılan hücreler elde edilmiştir ışık adapte, yetişkin, su fazlı kaplan semenderlerin (Ambystoma tigrinum), uzunluğu 17-22 cm (Charles Sullivan Inc, Nashville, TN), 5 muhafaza ° C 12 saat: 12 saat ışık-karanlık döngüsü. Protokolleri Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanan ve Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün kurallarına sıkı sıkıya bağlı bir New Jersey Tıp ve Diş Hekimliği Üniversitesi Komitesi (IACUC) kullanın. Retinal hücre kültürlerinin hazırlanması için prosedürler Nachman-Clewner ve Townes-Anderson (1996) tarafından açıklanan ve aşağıdaki gibidir:
- Hayvanların başını kesmek ve ilik. Gözlerinizi çıkarın ve kornealar ve iris teşrih. Retina Göz yuvası içinde biraz ayırmak gerekir. Kavisli bir forseps retina altına yerleştirerek, retina kepçe. Lens bu aşamada retina bağlıysa önemli değildir.
- 40 dakika için 14 U / ml semender Ringer solüsyonu papain (Worthington, Freehold, NJ) retina Digest.
- Kullanmadan önce, papain Ringer solüsyonu 30 dakika boyunca% 95 O 2 /% 5 CO 2 gaz ile kabarmış olmalı, daha sonra 0.22 mikron filtre (Millipore, Carrigtwohill, İrlanda) geçişi ile sterilize .
- Steril semender Ringer solüsyonu üç kez retina durulayın.
- Ringer çözüm lensleri çıkarın, sonra yavaşça bir hücre süspansiyonu verim pipet delik 3 mm ile retina dokusunun çiğnemek.
Lazer cımbız manipülasyon izole nöronların
- , Tabak sahnede bir referans noktası ile bir işareti hizalayarak çanak yönlendirilmesi, mikroskop sahnede kültür tabağına yerleştirin. Koordinatları bilgisayara fiducial puan kaydedin.
- Plaka Sal-1 hem de üzerine hücreleri ve çanak poli-HEMA yarısı.
- Hücrelerin antikor substrat eklemek için çanak yapışık tarafta hücreler için yeterince uzun olan, yaklaşık 20 dakika boyunca yerleşmek için izin verin.
- Sal-1 yapışık yemeğin tarafında bir hücre seçin. X ve y aşamada hücre yakın bir konumda koordinatları işaretleyin. Bizim durumumuzda, nokta seçili hücre birincil dendrit yaklaşık 10μm. Koordinatları bilgisayara kaydedin.
- Yemeğin poli-HEMA tarafında bizim durumumuzda bir fotoreseptör ikinci bir nöron, seçin ve onu yakalamak için lazer cımbız aracını kullanın. Yakalama, geniş bir aralıkta güç seviyeleri elde edilebilir. Ancak, biz% 10 hücre ile birlikte yakalama enkaz önlemek için yeterince düşük -20%, lazer güç, ancak orta yoluyla hücre taşınması için yeterli.
- Tuzak hücre tutarken, böylece hücre kültür çanak yüzeyinden ve herhangi bir bağlı nöronlar üzerinde evresini. Sal-1 tarafında önceden kaydedilmiş x ve y koordinatları hücre getirmek için bilgisayar kontrolü altında sahne taşıyın. Sahne hareketi 8-20μm / s olarak belirlendi, ancak maksimum hız ampirik olarak tespit edilmelidir. Sal-1 tarafındaki varış noktasına vardıklarında, çanak yüzeyinde sıkışıp hücre getirmek için sahne yükseltmek. Hücre yerleştirme birkaç mikron hassasiyetle yapılabilir. Sal-1 substrat hücre uymak için izin ver.
- Çifti oluşumu öncesi ve sonrasında çiftin iki hücrelerinin sayısallaştırılmış görüntü elde edilmesi yararlı bir kayıt sağlar.
- Bir kuluçka hücre çiftleri koruyun. Semender hücreleri için, 10 nemlendirilmiş bir odasında yemekleri ° C Hücreler video zaman atlamalı tarafından izlenmekte ve gerekli her türlü hücre biyolojik tekniği ile kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Işık momentumu vardır ve bir hücre geçerken kırılan bir ışık ışını zaman, bir kuvvet momentum yönünü değiştirmek için gerekli. Çünkü momentumun korunumu yasası, ters yönde bir kuvvet, sırayla, bir hücre tepki vermelidir. Ashkin (1991) mikroskop objektif lens ile odaklanmış bir lazer ışını tarafından üretilen kuvvet, bir hücre odak merkezine doğru hareket edeceğini gösterdi. Bir lazer ışını sadece birkaç piconewtons güç üretir rağmen, bu gücün, orta aracılığıyla bir hücre çekmek için yeterli. Kötü su tarafından emilir yakın kızılötesi dalga boyu (Liu ve ark 1995) hücre hasarı önlemek için kullanılır. Laboratuvarda kullanılan lazer cımbız istasyonu (Hücre Robotik A.Ş., Albuquerque NM) 980nm dalga boyu 1 W, sürekli dalga diyot lazer kullanır. Lazer ışık mikroskop aynı odak düzlemli ışın odaklanır yüksek sayısal açıklık 40x yağ daldırma planı neofluor objektif lens (NA1.3) (Carl Zeiss A.Ş.) aracılığıyla hücrelere iletilir.
Lazer cımbız kontrollü mikromanipülasyon rastgele kaplı hücreleri üzerinde çalışmalar üzerinde bir takım avantajlar sunuyor. Örneğin, hücreleri manipüle tüm hücreler için standart olabilir başka istediğiniz bir mesafe konabilir. Buna ek olarak, lazer ışını kültür çanak şeffaf yüzeyi geçer ve bu nedenle, hücre manipülasyon kapalı, steril bir ortamda yapılır. Lazer tarafından oluşturulan çok küçük kuvvetlerle yakalanan bir sınır koyar. Bizim tecrübelerimize göre, yapışma ve hücre şekli başarılı yakalama sınırlayan en önemli faktörlerdir. Genel olarak, çapı 10-15μm izole hücrelerin yakalamak ve onları hedeflerine kültür çanak boyunca birkaç milimetre mesafeler taşıma. Bunların dışında daha büyük hücreleri hareket etmek mümkündür, örneğin, uzunluğu 20-40μm ve kültürlerde en büyük hücrelerdir Müller glial hücreler.
Hücreleri yakalama hücrelerin kültür çanağı cam alt ve birbirine yapışır bir meydan okuma olduğu için, gelişmekte olan poli-HEMA kullanarak coverglass bir hücre itici yüzey hücreleri manipüle bizim başarı için çok değerli olduğunu kanıtladı. Böyle bile olsa, poli-HEMA yüzey hücreleri sonunda 1-2 saat daha eski kültürlerin işlemek için stickier ve zor oldu. Eski kültürlerde yaygın bir uygulama laboratuarımızda maksimum güç ayarı kullanarak lazer ile hücreleri almak için denemek için, o zaman taşıma gücü kısın.
Küçük nesneleri lazer sıkışıp kolaylığı ile enkaz hücre dışına mesafelerden tuzağa çekilebilir anlamına gelir. Bu bizim hücrelerinin yakalama sırasında bir sorun olduğunu kanıtladı. Bu tuzak içinde hücre tutabilir mümkün olan en düşük lazer güç aşağı çevirerek, çoğu durumda önlenebilir. Hücreler tuzak taşınabilmektedir hangi hızda orta viskozite ile sınırlıdır. Biz normalde için güvenli bir ulaşım aralığında olduğu tespit edildi 8-20 mikron / saniye hızını ayarlayabilirsiniz.
Lazer tuzak düzenlenen hücreleri üzerinde zararlı etkileri olduğunu olasılığı dikkate alınmalıdır. Retina kültürlerde, lazer ışını yakalanan imha edilir pigment hücreleri gibi koyu nesnelerin karşılaşıyoruz. Açıkçası, bu nedenle, bu hücrelerin lazer cımbız kullanarak incelenecektir olamaz. Clarke ve arkadaşları 2008; Ancak, daha önceki çalışmalarda retinal nöronlar ve laboratuvarda yürütülen fotoreseptör (Townes-Anderson ve ark 1998 nöritik büyüme ve cımbız manipüle hücreleri ve manipüle edilen hücreler arasında bağlantı kurma kapasitesi açısından bir fark bulundu. .)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Araştırma NIH Grants EY012031 ve EY0182175 ve FM Kirby Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR international | 48380 080 | |
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning | 7078A-5 | |
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc. | ||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss, Inc. | Numerical aperture (N.A. 1.3) | |
| Black and white CCD camera | Sony Corporation | ||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
