Faire patch pipettes et électrodes Sharp avec un extracteur programmable

Summary

Cette vidéo montre comment utiliser un tire-programmables pour les pipettes de patch et électrodes pointu pour l'électrophysiologie. La même procédure peut être utilisée pour faire une variété d'outils de verre, y compris les aiguilles d'injection.

Abstract

Microélectrodes de verre (aussi appelé pipettes) ont été un cheval de bataille de l'électrophysiologie pendant des décennies. Aujourd'hui, ces pipettes sont fabriqués à partir de capillaires en verre à l'aide d'un tire-programmables. Ces instruments de la chaleur du capillaire en utilisant soit un filament métallique ou d'un laser et d'en tirer le verre en utilisant la gravité, un moteur ou les deux. Pipettes pour patch-clamp sont formées en utilisant la chaleur et ne la gravité, tandis que des électrodes pour l'enregistrement intracellulaire forte d'utiliser une combinaison de la chaleur, la pesanteur, et un moteur. La procédure utilisée pour faire des pipettes d'enregistrement intracellulaire est semblable à celui utilisé pour faire des aiguilles d'injection pour une variété d'applications, y compris l'injection dans des ovocytes de Xenopus ARNc. En général, capillaire en verre <1,2 mm de diamètre est utilisé pour faire des pipettes pour l'enregistrement de patch-clamp, tandis que plus étroit de verre est utilisé pour l'enregistrement intracellulaire (diamètre extérieur = 1,0 mm). Pour chaque outil, l'extracteur est programmé de façon légèrement différente. Cette vidéo montre comment faire les deux types de pipettes d'enregistrement en utilisant des programmes pré-établis extracteur.

Protocol

Pipettes de traction

En utilisant une microélectrode extracteur comme le Sutter P-97 Flaming / Brown, tirer un ensemble d'environ 10-20 pipettes.

1. Sélectionnez votre verre capillaire. Nous utilisons borosilicate capillaires (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm de diamètre extérieur, diamètre intérieur de 1.1mm, 10cm de long). Conservez le verre avec soin afin qu'il reste propre et sans poussière.
2. Concevoir un programme de traction. Nous utilisons un programme en 5 étapes, avec la chaleur et la vitesse de descente à chaque étape, et une traction sur la petite la dernière étape. Livre de Sutter pipette est une excellente référence pour l'élaboration de programmes appropriés.
3. Examiner les embouts de pipette sous un microscope pour déterminer le diamètre d'ouverture et de douceur. Jeter rugueux, inégaux des conseils, ou irrégulière. Un bon protocole tirant devrait s'assurer qu'ils sont rares. Pour la norme patch-clamp, les ouvertures de pointe doit être microns 1-3 dans diamètre. Un cône fort (émoussé la pointe) entraîne une diminution de résistance pour le diamètre même ouverture. La forme et la taille peut être modifiée par le polissage de pression.

Pipettes de polissage au feu

1. Mettre en place une plate-forme de polissage (microforge) avec un filament de chauffage de platine contrôlés par une pédale. Un kit utile est disponible à partir ALA scientifique (CPM-2) ou un appareil similaire peut être assemblé au coup par coup.
2. En option: Manteau de la pipette avec un isolant pour diminuer la capacité et améliorer les caractéristiques de bruit. Nous utilisons de la cire dentaire. Sylgard 184 ™ (poly-diméthyl siloxane élastomère également connu comme PDMS) est également une option.
3. Si vous utilisez de la cire, garder une petite réserve fondue à proximité. Avec une pression d'air sur le dos de la pipette pour garder la cire d'entrer dans la pipette, tremper brièvement pointe dans la cire liquide et à enlever. Avec Sylgard, stocker élastomère préparé en aliquots congelés et peindre la pointe de la pipette sous un microscope. Chauffer pour guérir l'élastomère.
4. Placez la pipette (couché ou non) dans l'appareil de polissage et de mettre le bout ~ 50 microns à partir du filament. Gardez à l'esprit que le filament se développer lorsqu'il est chauffé.
5. Recommandé: Suivez le protocole distinct pour "polir la pression" pour changer la forme de la pipette pour une résistance optimale et diamètre de la pointe.
6. Une brève impulsion de chaleur (1-2 secondes) est suffisant pour enlever la cire de la pointe de la pipette et lisse du verre.
7. Placez la pipette fini dans une boîte fermée à l'abri de la poussière, répétez l'opération pour 10 pipettes de succès.

Discussion

Le protocole est illustré ici, dans une utilisation quotidienne dans les laboratoires d'électrophysiologie et est également utilisé pour faire des aiguilles d'injection pour les cellules et les animaux. Avec un extracteur programmables, il est facile de faire des pipettes pour une variété d'utilisations. Avec une attention et des soins, le filament sur votre extracteur va durer un an ou plus. Bonne chance avec vos expériences.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	P-97	Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries	Reagent	Sutter Instrument Co.	BF150-86-10	Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.