Göra Patch-pipetter och Sharp Elektroder med en programmerbar Puller

Summary

Denna video visar hur man använder en programmerbar avdragare för att göra patch pipetter och skarpa elektroder för elektrofysiologi. Samma förfarande kan användas för att göra en mängd olika glas verktyg, inklusive injektionsnålar.

Abstract

Glas microelectrodes (även kallad pipetter) har en arbetshäst elektrofysiologi i årtionden. Idag är en sådan pipetter av glas kapillärerna med hjälp av en programmerbar avdragare. Sådana instrument värma kapillär med hjälp av antingen en metall glödlampor eller en laser och dra ut glaset med allvar, en motor eller både och. Pipetter för patch-clamp inspelning bildas med enbart värme och allvar, medan vassa elektroder för intracellulär inspelning använder en kombination av värme, allvar och en motor. Förfarandet används för att göra intracellulära inspelning pipetter liknar den som används för att göra injektionsnålar för en mängd olika tillämpningar, inklusive Crna injektion i Xenopus oocyter. I allmänhet kapillär glas <1,2 mm i diameter används för att göra pipetter för patch clamp inspelning, medan smalare glas används för intracellulär inspelning (ytterdiameter = 1,0 mm). För varje verktyg är avdragare programmerat något annorlunda. Denna video visar hur man kan göra båda typer av inspelning pipetter med hjälp av på förhand fastställda avdragare program.

Protocol

Dra pipetter

Med hjälp av en mikroelektrod avdragare som Sutter P-97 Flaming / Brown, dra en uppsättning av ca 10-20 pipetter.

1. Välj din kapillär glas. Vi använder borosilikat kapillärer (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm ytterdiameter, 1,1 mm innerdiameter, 10cm lång). Förvara glaset försiktigt så att det förblir rent och dammfritt.
2. Designa en dra-program. Vi använder en 5 stegs program, med fallande värme och hastighet för varje steg, och en liten dra på det sista steget. Sutter har pipett kokbok är en utmärkt referens för att utveckla lämpliga program.
3. Undersök pipettspetsar under ett mikroskop för att fastställa öppna diameter och jämnhet. Kasta grov, ojämn, eller oregelbundna tips. En bra att dra protokoll bör säkerställa att dessa är sällsynta. För standard patch-clamp inspelning ska spets öppningar vara 1-3 mikrometer i diameter. En brant kona (trubbig spets) leder till lägre motstånd för samma öppning diameter. Form och storlek kan ändras av trycket polering.

Brand polering pipetter

1. Inrätta en polering rigg (microforge) med en platina uppvärmning glödtråd styrs av en fotpedal. En användbar kit finns från ALA Scientific (CPM-2) eller en liknande apparat kan monteras bit för bit.
2. Tillval: Coat pipetten med en isolator för att minska kapacitansen och förbättra buller egenskaper. Vi använder dentala vax. Sylgard 184 ™ (poly-dimetyl siloxan elastomer även känd som PDMS) är också ett alternativ.
3. Om du använder vax, hålla ett litet smält utbud i närheten. Med lufttryck på baksidan av pipetten för att hålla vax från att komma in pipetten, doppa spetsen kort i flytande vax och ta bort. Med Sylgard, lagra beredd elastomer i frysta alikvoter och måla pipettspetsen under ett mikroskop. Värm att bota elastomer.
4. Placera pipetten (bestruket eller inte) i polering apparaten och sätta spetsen ~ 50 mikrometer från glödtråden. Tänk på att glödlampan kommer att expandera vid uppvärmning.
5. Rekommenderas: Följ separat protokoll för "trycket polering" för att ändra formen på pipetten för optimal motståndskraft och dricks diameter.
6. En kort uppvärmning puls (1-2 sekunder) är tillräcklig för att ta bort vax från spetsen av pipetten och jämna glaset.
7. Placera den färdiga pipetten i en sluten låda för att skydda från damm, upprepa för 10 framgångsrika pipetter.

Discussion

Protokollet bilden är här i dagligt bruk i elektrofysiologi laboratorier och används också för att göra injektionsnålar för celler och djur. Med en programmerbar avdragare är det lätt att göra pipetter för olika användningsområden. Med uppmärksamhet och omsorg, kommer glödtråden på din avdragare pågå i ett år eller längre. Lycka till med dina experiment.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Micropipette Puller	Instrument	Sutter Instrument Co.	P-97	Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries	Reagent	Sutter Instrument Co.	BF150-86-10	Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.