Summary
Fondamentali, le proprietà ancora unica del sistema olfattivo dei roditori hanno portato al suo studio in aumento tra i biologi. Una valutazione relativamente semplice della sua funzione è poi anche necessario. Qui si descrive test sensibili per la caratterizzazione della sensibilità del mouse olfattivo e preferenza.
Abstract
Il sistema olfattivo dei roditori è di crescente interesse per gli scienziati, ha studiato, in parte, alla biologia dei sistemi a causa della sua stereotipata, circuiti ancora accessibile. Inoltre, la capacità unica di questa zona di generare nuovi neuroni per tutta la vita di un organismo rende un sistema interessante per i biologi dello sviluppo e rigenerante allo stesso modo. Tale interesse richiede un mezzo per una rapida valutazione, ma affidabile della funzione olfattiva. Molti test di capacità olfattive sono complesse, variabili o non specificamente progettati per i topi. Inoltre, alcuni test sono sensibili al deficit di memoria e difetti di abilità olfattiva, confondendo risultati ottenuti.
Qui, descriviamo una semplice batteria di test volti a identificare i difetti della sensibilità olfattiva e di preferenza. In primo luogo, un primo bilancio di salute generale consente l'identificazione degli animali adatti per ulteriori test. In secondo luogo, i topi sono esposti a diluizioni diverse di profumi per accertare se c'è una differenza di soglia. In terzo luogo, i topi sono presentati con profumi diversi, sia attraente e avversione, che consentono la valutazione di preferenza olfattiva. Questi studi dovrebbero rendere semplice la prima caratterizzazione di comportamento olfattivo accessibile per i laboratori di risorse e competenze diverse.
Protocol
Generale Sanità esame
Un trattamento più completo degli esami di salute generale può essere trovato in risorsa eccellente Jacqueline Crawley fenotipo comportamentale, Cosa c'è di sbagliato con il mio mouse? 1. Per prima cosa utilizzare una batteria modificata prova osservazionale per valutare la salute generale del soggetto. La batteria comprende elementi dal protocollo completo di Samuel Irwin valutazione 2 per identificare rapidamente quei soggetti che saranno adatti per ulteriori test. In breve, la batteria modificata identifica gli animali che sono fisicamente anormali (es. gravemente sotto-o sovra-peso, mal curato, dispnea) o che presentano anomalie postura, locomozione o comportamenti. Tutti questi possono essere manifestazioni della malattia. Qualsiasi valutazione iniziale che identifica in modo simile soggetti malsana è appropriato.
E 'anche importante notare che gli animali sono utilizzati umanamente sia durante l'esame di salute generale, così come durante i test successivi. Nessuna anestesia o analgesia viene utilizzato come tali esami non incorporano alcuna procedura potenzialmente dolorosa.
Sensibilità test olfattivo
Questo test è progettato per rilevare una differenza di sensibilità olfattiva tra due gruppi di topi (es. un wild-type e un gruppo di animali mutanti). In questo test, diluizioni più di un profumo sono fatti. Un animale ingenuo indaga poi una sola diluizione di questo profumo e il tempo totale esplorativa (entro 3 minuti) viene registrato. Diluizioni multiple del profumo sono testati su differenti, soggetti naïve e il tempo totale esplorativa viene utilizzato per generare le curve dose-risposta per ogni gruppo di topi. Due ricercatori dovrebbero essere coinvolti nei test, con una cieca genotipi soggetto e / o condizione.
Ricercatore principale
- Ottenere quattro gabbie pulite (8 x 10 W x 18 L, in pollici), il tutto senza biancheria da letto. Allineare i quattro gabbie nell'armadio biosicurezza.
- Impostare le partizioni tra ogni arena utilizzando opaca carta da filtro. Posizionare un bordo nero manifesto tutta la partizione finale in modo tale che le linee laterali nere laterali e fondo della gabbia. Coprire la parte superiore dell'arena con un pezzo di plexiglass trasparente per permettere alla luce di illuminare l'arena.
(A)
(B) 
Figura 1. Arena Set-Up. (A) conoscenza drappeggiato, arena vuota (b) Arena con soggetto e profumata carta da filtro. - Iniziare abituare i soggetti. Posizionare il primo soggetto nella gabbia prima assuefazione. Dopo 15 minuti, passare il primo soggetto alla gabbia secondo. Pulire la gabbia prima con TB Quatricide. Successivamente, posto il secondo soggetto nella prima, gabbia pulita. Continuare questo processo con i soggetti successive. In definitiva, ogni soggetto deve essere abituati a tutte e tre le gabbie prima di essere immessi nell'arena (gabbia quarta e finale) per altri 15 minuti di assuefazione prima del test.
(B) 
Ricercatore cieco
- Effettuare un numero adeguato di 2 pollici da 2 pollici quadrati di carta da filtro per i campioni di profumo.
- Utilizzando il pre-selezionati profumo, opportunamente diluirlo. Per i campioni idrofobo come il burro di arachidi, usare il petrolio come solvente, per tutti gli altri, usare acqua distillata. Vortex.
- Impostare un dispositivo di registrazione video digitale in fondo dell'armadio biosicurezza tale che l'estremità gabbia tutto è a fuoco. Prendete un video preliminare per garantire i parametri sono adeguati.
- Registrare l'ordine in cui diluizioni sarà testato, avendo cura di casuale l'ordine delle prove.
- Soggetto record rifiuti e numeri di identificazione.
- Una volta che il soggetto è stato abituato per 15 minuti in campo, iniziare la preparazione per la prima prova. Pipetta prima diluizione su e giù nel tubo conico prima pipettaggio che su una piazza carta da filtro. La superficie del filtro di carta in modo ottimale dovrebbe essere coperto ~ 85% (circa 0,50 ml di soluzione). Utilizzare un kimwipe per assicurarsi che la carta da filtro non è eccessivamente saturo.
- Iniziare la registrazione video.
- Posizionare la piazza filtro di carta nella gabbia sul lato opposto della posizione attuale dell'animale.
- Iniziare il cronometraggio.
- Dopo 3 minuti, interrompere la registrazione e rimuovere il profumo diluito.
- Se solo un profumo (ad esempio la cannella) è da verificare, rimuovere il primo soggetto di test dall'arena. Ripetere i passaggi 6-11 per ogni animale, diluendo opportunamente il profumo per ogni soggetto. Se più di un profumo è da verificare, tuttavia, non rimuovere il soggetto prova dall'arena. Invece, iniziare il cronometraggio.
- Opportunamente diluire il profumo successiva utilizzando gli stessi metodi sopra elencati.
- Dopo 1 minuto, iniziare la registrazione video. Posizionare la piazza filtro di carta con la diluizione del profumo successivo nella gabbia sul lato opposto della positio attuale dell'animalen.
- Ripetere i passaggi 6-13 per ogni profumo, notando il numero di file video per ogni prova.
- Ripetere i passaggi 6-14 per ogni soggetto.
Figura 2. Risultati rappresentativi per una sessione di test di sensibilità olfattiva. Ogni topo sia dal gruppo di controllo (gruppo A) o il gruppo sperimentale (Gruppo B) è stata esposta a una delle cinque diverse diluizioni di estratto di cannella su carta da filtro per uno, tre minuti di sessione. Tempo totale di esplorare la carta da filtro è stata valutata. I topi del gruppo A hanno una maggiore sensibilità olfattiva di quelli del gruppo B.
Preferenza test olfattivo
Questo test è progettato per identificare carenze di rilevazione specifica, cioè la capacità di percepire i profumi attraenti o avversione. La procedura che segue prende in prestito liberamente dal protocollo di Kobayakawa, K., et al.3. Ancora una volta, due ricercatori dovrebbero essere coinvolti nei test, con una cieca genotipi soggetto e / o condizione. Il tempo totale esplorativa è ancora una volta registrato (su visualizzazione video) per profumi diversi. Quei profumi con totale esplorative volte maggiore di acqua sono designati come "attraente", mentre quelli con volte meno acqua sono definiti "avversione". Il ricercatore si chiede poi se gli stessi profumi sono "attraenti" o "avversione" per i soggetti di prova differenti.
Si prega di seguire i passaggi 1-3 nella sezione olfattivo test di sensibilità per il ricercatore principale.
Ricercatore non vedenti
La procedura per il collaudo preferenza olfattiva è la stessa, con lievi modifiche di passi 2 e 4. Si prega di seguire i passaggi 1-15 nella sezione olfattivo test di sensibilità per il ricercatore non vedenti, con le seguenti modifiche: Per il punto 2, usando il pre-selezionato profumi (una combinazione di profumi attraenti e avversione), fanno soluzioni opportunamente diluite di ciascuno in tubi conici. Per i campioni idrofobo come il burro di arachidi, usare il petrolio come solvente, per tutti gli altri, usare acqua distillata. Vortex. Per il punto 4, invece di registrare la diluizione da testare, registrare l'ordine dei profumi vario che sarà testato, randomizzare l'ordine delle prove.
Questo test è progettato per identificare carenze di rilevazione specifica, cioè la capacità di percepire i profumi attraenti o avversione. La procedura che segue prende in prestito liberamente dal protocollo di Kobayakawa, K. et al. 3. Ancora una volta, due ricercatori dovrebbero essere coinvolti nei test, con una cieca genotipi soggetto e / o condizione. Il tempo totale esplorativa è ancora una volta registrato (su visualizzazione video) per profumi diversi. Quei profumi con totale esplorative volte maggiore di acqua sono designati come "attraente", mentre quelle con volte meno acqua sono definiti "avversione". Il ricercatore si chiede poi se gli stessi profumi sono "attraenti" o "avversione" per i soggetti di prova differenti.
Si prega di seguire i passaggi 1-3 nella sezione olfattivo test di sensibilità per il ricercatore principale.
Ricercatore non vedenti
La procedura per il collaudo preferenza olfattiva è la stessa, con lievi modifiche di punti 2, 4 e 13. Si prega di seguire i passaggi 1-15 nella sezione olfattivo test di sensibilità per il ricercatore non vedenti, con le seguenti modifiche: Per il punto 2, usando il pre-selezionato profumi (una combinazione di profumi attraenti e avversione), fanno soluzioni opportunamente diluite di ciascuno in tubi conici. Per i campioni idrofobo come il burro di arachidi, usare il petrolio come solvente, per tutti gli altri, usare acqua distillata. Vortex. Per il punto 4, invece di registrare la diluizione da testare, registrare l'ordine dei profumi vario che sarà testato, randomizzare l'ordine in ogni prova. Per il passaggio 13, posto sulla piazza filtro di carta con il profumo successivo nella gabbia sul lato opposto della posizione attuale dell'animale.
Figura 3. Risultati rappresentativi per una sessione di test olfattivi preferenza. Ogni mouse è stato esposto a ciascuno dei diversi profumi su carta da filtro per uno, tre minuti di sessione. Tempo totale di esplorare la carta da filtro è stata valutata. Burro di arachidi e vaniglia sono profumi attraenti (profumo esplorativa volta> acqua momento esplorativo) e 2-Methylbutyric acido è avversivo (profumo esplorativa volta <acqua momento esplorativo).
Punteggio del test olfattivo
Dopo aver acquisito tutte le sensibilità olfattiva e video preferenza, è necessario analizzare il tempo totale trascorso esplorando ogni diluizione / profumo. Hanno il ricercatore cieco analizzare tutti i video di coerenza.
- Anteprima del video, rilevando quanto segue: a) quando la carta da filtro è posto in campo, b) quando il mouse si avvicina la carta da filtro, c) quando il mouse indaga la carta da filtro e d) quando i minuti sono trascorsi tre (da quando il filtro la carta è stata posta in campo). Sapere quando di concentrarsi sul comportamento del mouse, rende più facile segnare con precisione il tempo totale trascorso su di esplorare recensione.
- Rivedere il video. Si noti il momento in cui il mouse indaga il primo filtro di carta (latenza).
- Utilizzando un cronometro, tempo tutte le indagini entro tre minuti di mettere la carta da filtro nell'arena. Il tempo di ricerca è definito come qualsiasi periodo in cui narici del mouse sono <1 mm dalla carta da filtro. È importante non includere qualsiasi parte del tempo quando il mouse si trova in prossimità della carta da filtro, ma non è attivamente indagando. Non includere attacchi di masticare e leccare la carta o attacchi di seduta sulla carta nel tempo totale esplorativa. E 'necessario attenersi strettamente e coerentemente a queste regole di analizzare con precisione il comportamento olfattivo.
- Latenza tempo di record, il tempo totale trascorso indagando il filtro con il numero di file video.
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Discussion
I test di cui sopra consentire la valutazione rapida e affidabile di base funzione olfattiva. Non è da trascurare, tuttavia, che questo richiede affidabilità la selezione e la preparazione di soggetti per il test. Gli animali malati o comunque inabili sono spesso soggetti dei test incoerente. Inoltre, l'abitudine dei soggetti testati è la chiave. Abbiamo trovato che l'uso di gabbie multiple durante il processo di assuefazione permette agli animali per familiarizzare con la manipolazione sperimentatore e cambiare ambiente. Abbiamo anche trovato che i tempi più brevi di quelli indicati per abitudine non sono sufficienti a ridurre l'ansia. Gli animali sono spesso ansiosi anche i soggetti di prova imprevedibile e può oscurare le differenze vere.
Nella prova vera e propria dei topi, è importante non solo per essere coerenti quando acquisizione dei dati, ma anche per analizzare il comportamento dei soggetti '. Abbiamo ritenuto utile per contare solo quella volta che il naso del soggetto del test è <1 mm dal filtro di carta come parte del tempo totale esplorativa. Inoltre, comportamenti come mordere o masticare la carta da filtro non sono inclusi nel tempo totale esplorativa. Inoltre, il tempo di latenza (per profumi attraenti) può essere un parametro utile. Diversa estrazione topi può richiedere diverse diluizioni di profumi di discriminazione effettiva tra un controllo e gruppo sperimentale. E 'anche importante per sesso ed età-match-match coppie. Abbiamo trovato utile empiricamente derivare diluizioni profumo appropriato (su argomenti simili al gruppo di controllo) prima di procedere con la verifica sperimentale di topi ingenui. Infine, questi test sono stati selezionati per ridurre al minimo l'effetto di eventuali altre menomazioni cognitive, soprattutto, difetti di apprendimento e / o della memoria. A tal fine, è fondamentale usare i topi ingenui per il test.
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Acknowledgments
Finanziamento: Questo lavoro è stato sostenuto da un HQ Stuart & Victoria Fellowship Quan Predoctoral (RMW), NIH premio Pioneer (RAS)
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutyric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | W269506 | Concentrations Used:9.16 x 10-1 – 10-8 M (in H20) |
| Pure Vanilla Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy) | Reagent | Unilever | n/a | Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil |
| Cinnamon Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Mineral Oil, light | Reagent | Fisher Scientific | O121-1 | Concentrations Used:N/A |
References
- Crawley, J. N. What’s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley and Sons. 42-60 (2007).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Kobayakawa, K. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450, 503-508 (2007).
