여기서 우리는 분리 방법 및 출생 후의 마우스 문화 소뇌 과립 신경 세포의 전구 세포와 소뇌 과립 신경을 제시.
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이 논문에서
요약
초록
소뇌 피질의 연결 속성과 개발 1,2를 공부에 대해 고유한 기회를 제공하는 잘 설명하는 구조입니다. 소뇌의 연결 유형 (과립 세포, Purkinje 세포와 억제 interneurons)의 과립 뉴런은 지금까지 가장 많은 있으며, 포유류의 두뇌에 신경 가장 풍부한 타입입니다. 설치류 동물에서 소뇌 과립 신경이 소뇌 피질, 외부 과립 층 (EGL)의 바깥쪽 레이어의 전구 세포에서 처음 두 포스트 나탈 주 동안 생성됩니다. 여기에 제시 프로토콜은 풍부 기술과 문화 과립 신경 및 사후 나탈 마우스 소뇌에서 자신의 전구 세포를 설명합니다. 우리는 과립 신경 5,6에 전구 세포를 proliferating의 차별을 연구하는 데 사용할 수있는 순수 증가 3,4의 문화를 구하는 절차를 설명합니다. 일단 전구 세포는 문화가 또한 synaptogenesis, 글루 탐 산염 수용체 기능 7, 기타 정화 소뇌 세포 8,9 또는 세포 사망 7 상호 작용과 같은 현상의 실험적 조작 및 특성에 대한 과립 뉴런의 동질적인 인구를 제공, 차별.
프로토콜
1 부 : (동영상에 표시되지 않음) (1-2일 절개 전) 설정
- 문화 솔루션과 미디어 준비 :
- 4X CMF - PBS - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (Percoll의 dilutions을위한 칼슘, 마그네슘 자유 인산 버퍼 호수 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) : 당 리터, 32g NaCl, 1.2 g KCl, 8g 포도당, 2g 아니 2 PO 4 1g KH 2 PO를 추가 4, 8 ML 2% NaHCO 3 재고, deionized / 증류수 10 ML 1M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (산도 8.0). 1리터 및 7.4에 산도로 볼륨을 조정합니다. 소독 필터.
- HBSS - 포도당 : 칼슘, 마그네슘 무료 행크의 밸런스 소금 솔루션 (HBSS) 및 살균 필터에 추가 포도당 (6g / 리터). 500 ML은 ° C 한달에 최대 4 저장할 수 있습니다.
- 문화 미디어 : 혈청이없는 매체 (SFM)와 10 % FBS 배지. 48 ML하기 Neurobasal - 중간 500 μl 100X GlutaMAX I, 500 μl 100X의 페니실린 - 스트렙토 마이신 (최종 100 단위의 페니실린....
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토론
이 프로토콜은 과거 3,7,11에서 설명했습니다 절차의 변경에 따라 달라집니다. 아래의 논의로 참고하기 위해 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다.
과립 신경 및 전구 세포는 도금 2 시간 이내에 준수. 건강한 세포의 위상 대비 현미경 4 아래 둥근 형태 있습니다. 도금 후 24 시간 이내에, 건강한 세포는 coverslips 또는 플라스틱 잘 주위에 균일하게 확산하고, 프로세스를 형성합니다. 최초의 매체 변화의 시간에 24 시간 후, 몇 죽은 세포 부동있을 것입니다. 몇 세포 분리 과정에서 죽게하거나 건강에 해로운가 될로서 이것은 정상입니다. 48 시간 후 세포가 자신의 프로세스에 varicosities 함께 clumped있다면 그러나, 세포는 건강에 해롭습거나 폴리 - D - 라이신 기판은 독성도. 대부분의 기판과 마찬가지로, 폴리 - D - 라이신의 효능은 많이 의존하고 있으며 각각의 새로운 많은 테스트해야합니다. 건강한 문화의 이미지를 참조 4,11, 20에서 찾을 수 있습니다. 건강한 .......
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감사의 글
우리는 소중한 제안 바바라 Carletti과 안나 마리 케니 감사합니다. , DK07328 : HYL는 교육 부여 "생화학 및 분자 생물학 호르몬"에 의해 지원됩니다. NIH 교부금 5R01 NS16951 (CAM)에 의해 부분적으로 지원.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 70μm 메쉬 기공 셀 스트레이너 | BD Biosciences | 352350 | |
| 척수 바늘 | BD Biosciences | 405182 | 20G x 3-1/2 inches |
| Poly-D-Lysine 분자량>300,000 | Sigma-Aldrich | P1024 | Poly-D-Lysine의 각 새 배치는 반드시 테스트해야 함. |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P-1644 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175-103 | 칼슘 및 마그네슘이 포함되지 않아야 함. |
| Neurobasal A-Medium | Invitrogen | 10888-022 | |
| Glutamax I 보충제 | Invitrogen | 35050-061 | |
| B-27 무혈청 보충제 (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| 12-mm 원형 커버슬립 | Carolina Biological | 63-3029 | 독일 Deckgluder 제품임. |
| 25-mm 원형 커버슬립 | Carolina Biological | 63-3037 | 독일 Deckgluder 제품임. |
| Papain 분리 시스템 | Worthington Biochemical | LK 003150 | 키트 하나당 5회 분리에 적합함. |
| Permaset 가위 | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6782 | |
| Dumont #5 (Dumostar) | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4978 | |
| 4-웰 배양 접시 | Nalge Nunc international | 176740 | |
| 6-웰 배양 접시 | Nalge Nunc international | 140685 |
참고문헌
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system: in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. Boca Raton. (1997).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Annual Review of Neuroscience. 18, 385-285 (1995).
- Hatten, M. E., Gao, W. -Q., Morrison, M. E. in Culturing Nerve Cells<....
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재인쇄 및 허가
