Isolamento e la coltura di cellule post-Natal Neuron cerebellare granuli mouse progenitore e Neuroni

Summary

Qui vi presentiamo un metodo per isolare e cultura dei granuli cerebellari cellule progenitrici dei neuroni e neuroni granuli cerebellari da mouse postnatale.

Abstract

La corteccia cerebellare è una struttura ben descritto che offre opportunità uniche per studiare le proprietà neuronali e ^1,2 di sviluppo. Dei tipi neuronali del cervelletto (cellule dei granuli, cellule di Purkinje e interneuroni inibitori), i neuroni dei granuli sono di gran lunga i più numerosi e sono il tipo più abbondante di neuroni nel cervello dei mammiferi. Nei roditori, i neuroni granuli cerebellari sono generati durante i primi due post-natale settimane da cellule progenitrici nello strato più esterno della corteccia cerebellare, lo strato granulare esterno (EGL). Il protocollo presentato qui descrive le tecniche per arricchire e neuroni dei granuli cultura e le loro cellule progenitrici dal post-natale del cervelletto mouse. Si descrivono le procedure per ottenere colture di purezza crescente ^3,4, che può essere utilizzato per studiare la differenziazione delle cellule progenitrici proliferano in neuroni dei granuli ^5,6. Una volta che le cellule progenitrici differenziare, le culture forniscono anche una popolazione omogenea di neuroni granulari per la manipolazione sperimentale e caratterizzazione di fenomeni come la sinaptogenesi, la funzione dei recettori del glutammato ^7, l'interazione con altre cellule purificate cerebellari ^8,9 o morte cellulare ^7.

Protocol

Parte 1: Impostazione (1-2 giorni prima della dissezione) (Non mostrato in video)

1. PREPARAZIONE SOLUZIONI CULTURA E MEDIA:
   • 4X CMF-PBS-EDTA (calcio e magnesio libero-tampone fosfato-EDTA per diluizioni Percoll): litro, aggiungere 32 g di NaCl, 1,2 g di KCl, 8 g di glucosio, 2 g di NaH ₂ PO _4, 1 g di KH ₂ PO _4, 8 ml al 2% NaHCO stock _3, 10 ml EDTA 1M (pH 8,0) a distillata / deionizzata. Regolare il volume di 1 litro e il pH a 7,4. Filtro sterilizzare.
   • HBSS-GLUCOSIO: Aggiungi glucosio (6 grammi / litro) al calcio e magnesio Salt libero di Hank Soluzione Balance (HBSS) e filtro sterile. 500 ml può essere conservato a 4 ° C per un massimo di un mese.
   • MEDIA CULTURA: mezzo privo di siero (SFM) e il 10% medio FBS. A 48 ml di Neurobasal A-Media aggiungere 500 microlitri 100X GlutaMAX I, 500 microlitri 100X penicillina-streptomicina (finale 100 unità penicillina e streptomicina 100 mg), 6,25 microlitri 2 M KCl (finale 250 mM). Diviso in 2 aliquote di 9 ml e 40 ml. Per preparare al 10% medio FBS, aggiungere 1 ml di calore FBS inattivato aliquota al 9 ml. Per preparare SFM, aggiungere 800 ml di siero senza supplemento B-27 per l'aliquota 40 ml. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 settimane. Per ottenere i migliori risultati rendono mezzi freschi per ciascun esperimento.
2. PREPARAZIONE DILUIZIONI Percoll:
   • Percoll è fornito come liquido e deve essere acidificato prima dell'uso. Per preparare il brodo, aggiungere 1N HCl a poco a poco alla soluzione Percoll per un periodo di 1-2 ore fino a pH 7,4 viene raggiunto. Aggiunta del HCl troppo rapidamente farà sì che il Percoll per aggregare. Circa 6.5ml di 1N HCl sono necessari per ogni litro di Percoll. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
   • A 35% e un 60% (vol: vol) diluizione Percoll saranno utilizzati nella fase gradiente Percoll. Preparare 100 ml di diluizioni Percoll contenente 35 o 60 ml di Percoll stock, 25 ml di 4X CMF-PBS-EDTA e distillata / deionizzata H2O al volume finale. Aggiungere poche gocce di blu di toluidina per la soluzione del 60%: ci aiuterà visualizzare l'interfaccia e le cellule. Filtro sterilizzare e conservare a 4 ° C.
   • 4X CMF-PBS-EDTA non dovrebbe avere più di 3 mesi, come il buffering inadeguata causerà la morte delle cellule è aumentato durante la procedura.
3. Coprioggetto PREPARAZIONE: coprioggetto di vetro (meglio se da Supply Company Carolina biologica) vengono lavati con il 10% HCl notte a temperatura ambiente con agitazione mite, sciacquati accuratamente con acqua distillata / deonized acqua e conservati in etanolo al 70%. Prima dell'uso, coprioggetto singole sono di fiamma sterilizzati con brevemente tenendo con una pinza su una fiamma libera (becco Bunsen) fino alla evapora etanolo. 12-mm coprioggetto di vetro può essere posizionato in 4 pozzetti cultura e coprioggetto da 25 mm in 6 pozzetti cultura.
4. NAVI RIVESTIMENTO CULTURA CON SUPPORTO: Per immunofluorescenza o trattamenti farmacologici in vetro coprioggetto sono più adatti in quanto possono essere facilmente montate su vetrini per la visualizzazione al microscopio. Quando un gran numero di cellule sono necessarie per la raccolta di campioni di RNA e proteine, le cellule possono essere coltivate sui piatti tradizionali della cultura plastica notte prima della dissezione, coprioggetto di vetro o piatti di plastica per la cultura devono essere rivestiti con poli-D-lisina (500 mg / ml; 800 microlitri / pozzetto per 6-pozzetti o 350 microlitri / pozzetto per 4-pozzetti). 5 mg / ml soluzione stock di poli-D-lisina è conservato a -20 ° C, poi diluito in distillata sterile / deonized acqua filtrata e sterile destra prima dell'uso. Recipienti di coltura vengono incubate a 37 ° C per una notte (o almeno per 2 ore prima placcatura) e lavato due volte con distillata sterile / deonized diritto all'acqua prima di placcatura.
5. Preparazione di piatti PREPLATING: Questi piatti saranno utilizzati per il pre-plating le cellule isolate cerebellari prima cultura per rimuovere i contaminanti gliali, che aderiscono più facilmente a una minore concentrazione di substrato. Cappotto due 60 mm di plastica con piatti di cultura 4 ml al piatto di poli-D-lisina (100 mg / ml; Nota questa è 1 / 5 della concentrazione usata per la coltura). Incubare a 37 ° C per una notte (o almeno per 2 ore prima della dissezione). Poco prima la dissezione, rimuovere il poli-D-lisina soluzione, lavare i piatti due volte con acqua sterile e lasciare asciugare nel cappuccio.
6. Sterilizzare gli strumenti dissezione in autoclave o il giorno della dissezione, immergere gli strumenti in etanolo al 70% per 20 minuti. Strumenti necessari: Permaset forbici, forbici microdissecting, quattro Dumont # 5 dissettore.

Parte 2: Preparazione per la dissezione (giorno di dissezione) - (dimostrato in video)

Tutte le seguenti procedure vengono eseguite in una cappa di coltura di tessuti a meno che celebre.

1. Pulire l'area dissezione con il 70% di etanolo. Riscaldare la media a 37 ° C a bagnomaria o in un 5% di CO ₂ 37 ° C incubatore.
2. Quando si avvia un nuovo sistema di papaina dissociazione Kit (Worthington), preparare la soluzione di albumina-ovomucoid inibitore. Aggiungere 32 mldi EBSS (soluzione salina bilanciata di Earle, fornito nel kit) per l'albumina-ovomucoid miscela inibitore e permettere il contenuto di sciogliere durante la preparazione degli altri componenti. Ricostituire per il primo utilizzo, poi conservare la soluzione rimanente a 2-8 ° C e utilizzare fino a cinque isolamenti consentiti da ogni kit sono stati completati.
3. Aggiungere 5 ml di EBSS ad un flaconcino papaina dal Kit dissociazione (ogni fiala è sufficiente per la dissociazione di 4-15 dal cervello dei topi dopo la nascita giorno 5). Porre la fiala papaina in un 5% di CO ₂ 37 ° C o incubatore a 37 ° C bagnomaria per 5 a 10 minuti fino a quando la papaina è completamente sciolto e la soluzione appare chiara. Mantenere la soluzione a temperatura ambiente durante la dissezione.
4. Aggiungere 500 ml di EBSS ad un flaconcino DNasi nel kit dissociazione. Mescolare delicatamente toccando il flacone dal DNasi è sensibile alla denaturazione taglio. Aggiungere 250 microlitri di questa soluzione al flacone contenente la papaina (concentrazione finale è di 20 unità / ml di papaina e DNasi 0,005%). Salva il flacone rimanenti DNasi per l'uso in fase 5.1 o 6.1.

Parte 3: dissezione e rimozione Meningi

1. L'età ottimale per la coltura dei granuli delle cellule di topo C57BL/6J è il giorno dopo la nascita 4-6, quando il numero di cellule progenitrici delle cellule dei granuli in EGL peaks1, 10. Sezionare cuccioli uno alla volta e come si diventa più familiarità con la dissezione cerebellare cercare di ridurre i tempi di dissezione, per non più di 6 minuti per ogni cucciolo. La velocità è essenziale.
   Se il passo gradiente Percoll è bypassato, otto giorni dopo la nascita-5 cuccioli di topo si possono ottenere cellule sufficiente per un 6-bene piastra di coltura (o sei coprioggetto da 25 mm) o per sei a 4 e piastre di coltura (o 24 12 - coprioggetto mm). Rendimento stimato è di 4 a 5x106 cellule per densità cucciolo e placcatura può variare tra 1 e 5x105 cells/cm2. Dato che le cellule del 15-20% vengono persi durante la step4 Percoll, più animali sono necessari per ottenere la stessa densità cella desiderata.
2. Pipettare 15 ml di HBSS-glucosio in una di 60 mm piatto di plastica coltura di tessuto e 10 ml in una sterile Falcon 15 tubo di plastica ml. Mettere in ghiaccio.
3. Al di fuori della cappa, pulire la testa del cucciolo con il 70% di etanolo. Usare le forbici Permaset di decapitare il cucciolo. (Decapitazione non verrà mostrato nel video).
4. Nel cappuccio, tenere la testa con una pinza Dumont in modo che si può vedere chiaramente la parte posteriore del cranio. Accedi al cervello con l'inserimento di forbici microdissecting nel foro occipitale e taglio dritto verso gli occhi. Con le pinzette e staccarsi la pelle e sollevare il cranio per esporre il cervello. Utilizzando pinze Dumont, pizzichi via il cervelletto e il mesencefalo circostante e trasferirlo al piatto con HBSS-glucosio. (E 'più facile manipolare il cervelletto e rimuovere le meningi se il cervelletto è ancora attaccato al tessuto circostante).
5. Sotto il microscopio da dissezione, delicatamente sbucciare le meningi fuori il cervelletto e anche tra i lobi con una multa Dumont # 5 forcipe durante l'uso del forcipe altro ancora lungo il cervelletto alla piastra. Noterete vasi sanguigni sulla superficie del cervelletto. Questi vasi sanguigni sono un buon modo per identificare le meningi. Rimuovere le meningi fino a quando il cervelletto assume un aspetto opaco bianco. Separare il cervelletto dal resto del mesencefalo. Girare per il suo lato ventrale ed estrarre il plesso coroideo, che si presenta come un nastro rosso tra il cervelletto e il mesencefalo ventrale adiacenti. Mettete ogni cervelletto a freddo HBSS-glucosio in un tubo da 15 ml su ghiaccio appena sezionato. Cambia la soluzione dissezione a fresco HBSS-glucosio dopo dissezione 3 cervelli.

Parte 4: sospensione cellulare

1. Una volta che tutte le dissezioni sono finiti, rimuovere il HBSS-glucosio dal tubo e sostituirlo con la soluzione di papaina effettuata nel passaggio 2.4. Anche se il kit raccomanda il taglio del tessuto in piccoli pezzi, troviamo che non è necessario tagliare o tritare il cervello dei a questa età. Posizionare il + soluzione papaina tessuto (in un tubo da 15 ml) nel 37 ° C in bagno d'acqua o 5% di CO ₂ 37 ° C incubatore per 15 a 20 minuti. Da 4 a 8 cervelletti, a 15 minuti a 37 ° C è sufficiente, per un numero maggiore di cervello dei 20 a 30 minuti è meglio. Agitare delicatamente il tubo ogni 3 o 4 minuti.
2. Triturare la miscela con un puntale sterile p1000 aerosol che è stato rivestito con FBS. Fare questo passo delicatamente per evitare la formazione di bolle d'aria. Pipette in vetro lucido fuoco può essere utilizzato, ma a nostro parere siero rivestito sterile p1000 suggerimenti aerosol funzionare altrettanto bene. Per ricoprire la punta della pipetta con FBS, FBS pipetta su e giù due volte prima dell'uso. Circa 10 su e giù per i movimenti con la pipetta sono sufficienti per dissociare il tessuto. La soluzione diventerà torbida. Consentono la sospensione a sedere per 30-60 secondi in modo che qualsiasi grossi pezzi di tessuto dissociato si depositerà sul fondo della provetta.
3. Rimuovere le cellule in sospensione (attenzione a non rimuovere i pezzi di tessuto non dissociato al bottom) in un nuovo tubo 15 ml con una punta di siero pipetta rivestito. Centrifugare a circa 200xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Preparare la risospensione media. Per fare questo, mix EBSS 2,7 ml con 300 ml di albumina ricostituito-inibitore ovomucoid soluzione in una provetta sterile. Aggiungere 150 ml di soluzione di DNasi dal punto 2.4.
4. Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e subito risospendere il pellet cellulare in diluita DNasi / soluzione inibitore albumina preparata al punto 4.3 con un siero rivestito p1000 aerosol puntale.
5. Preparazione di un gradiente discontinuo di densità come segue. Aggiungere 5 ml di albumina-ovomucoid soluzione inibitore ad un tubo da 15 ml. Con attenzione sospensione strato della cella in cima. Centrifugare a circa 70xg per 6 minuti a temperatura ambiente. Cellule dissociate pellet sul fondo del tubo, frammenti di membrana rimangono a livello di interfaccia.
6. Se si desidera ottenere colture che si arricchiscono in granuli, superare la fase di gradiente di Percoll di separazione (che produce le culture più pura di granuli cerebellari), e passare alla Parte 6. Se si desidera isolare ulteriormente le cellule gliali e granuli da interneuroni grandi per separazione gradiente di Percoll, passare alla Parte 5. L'uso del passo gradiente Percoll ridurrà il rendimento delle celle. Nelle nostre mani, la riduzione della resa è di circa 20-35%. Tuttavia, vi è un aumento della arricchimento dei neuroni dei granuli e cellule progenitrici di circa il 90% al 95-99%.

Parte 5: Separazione gradiente Percoll

1. Eliminare il supernatante e risospendere immediatamente il pellet in 2 ml di HBSS-glucosio con 50 ml di DNasi dal punto 2.4. Filtrare la sospensione cellulare anche se una maglia di nylon (dimensione dei pori 70 micron) per gravità. Questo passo sarà la rimozione di grandi cellule non neuronali e prevede una sospensione migliore singola cella.
2. Preparare due incendi lucidato vetro pipette Pasteur. Per fare questo, delicatamente fiamma la punta di una pipetta di vetro fino a quando il bordo è semplificate ed il foro pipetta è 40-50% delle dimensioni originali. Fare attenzione a non fare l'apertura troppo piccola.
3. Preparare gradiente Percoll. Introdurre 10 ml di soluzione di Percoll al 35% in una provetta sterile da 50 ml conica. Percoll 60% (10 ml) viene caricato con una siringa da 10 ml sterile con un ago sterile spinale allegato. Delicatamente lo strato di soluzione di Percoll al 60% sotto la soluzione al 35%, con l'aggiunta di una soluzione al 60% sul fondo del tubo con l'ago spinale. Aver cura di mantenere un'interfaccia netta tra i due strati. Aggiungi le cellule alla parte superiore del gradiente usando un incendio lucidato pipetta, aggiungere delicatamente lungo il lato del tubo senza disturbare l'interfaccia.
4. Posto con attenzione il tubo nella centrifuga e centrifugare a 1800xg. Rampa la velocità di un passo ogni 20 secondi (incrementi di velocità sono le seguenti: circa 18, 70, 200, 440, 850, 1100, 1800xg) in modo che ci vogliono circa 2 minuti per raggiungere la velocità desiderata. Avviare il timer a 10 minuti quando 1800xg è raggiunto. Al termine, diminuire la velocità gradualmente un passo ogni 20 secondi.
5. Rimuovere l'interfaccia superiore del gradiente (contenente glia grande, cellule di Purkinje, e interneuroni) e scartare.
6. Rimuovere con attenzione le cellule a livello di interfaccia tra il 35% e il 60% Percoll con un fuoco lucido pipetta e trasferirli in un tubo da 50 ml. Risospendere in 3 volumi di HBSS-glucosio e mescolare capovolgendo più volte. Centrifugare per 5 minuti a 1100xg.
7. Rimuovere il surnatante e aggiungere 4 ml di 10% di media FBS con 50 ml di DNasi. Risospendere il pellet delicatamente con un incendio lucidato pipetta per formare una sospensione singola cella. Passare al punto 6.2.

Parte 6: Pre-placcatura e placcatura

1. Eliminare il supernatante e risospendere immediatamente il pellet in 4 ml di FBS 10% medio con 50 ml di DNasi dal punto 2.4. Filtrare la sospensione cellulare anche se una maglia di nylon (dimensione dei pori 70 micron) per gravità. Questo passo sarà la rimozione di grandi cellule non neuronali e prevede una sospensione migliore singola cella.
2. Piastra le cellule raccolte in un poli-D-lisina rivestito pre-placcatura piatto per 20 minuti in un 5% di CO ₂ 37 ° C incubatore. Ripetere con un piatto fresco. Le cellule astroglia e più pesanti si stabilizzerà e rispettare i piatti e lasciare i neuroni dei granuli piccoli e cellule progenitrici dei neuroni galleggianti. Dopo l'incubazione, i neuroni granulari liberamente aderito e le cellule progenitrici dei neuroni sono spostano facilmente e allentato con lievi colpetti della piastra.
3. Raccogliere i neuroni dei granuli e le cellule progenitrici dei neuroni in un tubo da 15 ml e centrifugare a 200xg per 5 minuti. Risospendere il pellet in 1 ml di mezzo privo di siero e contare una aliquota di 10 microlitri con un emocitometro.
4. Aggiungere mezzo privo di siero per raggiungere la densità cellulare desiderato. Linee guida di massima per il numero di cellule per piastra per densità media: per 6-pozzetti da 3,5 a 4 milioni di cellule, per piatti 4-bene, 650.000 cellule. Per 6-pozzetti cultura, io piatto 1,5 ml / pozzetto e per 4 ben plates, io piatto 0,5 ml / pozzetto. Le cellule sono mantenute in un 5% di CO ₂ 37 ° C incubatore. Cambia il medium completamente 24 ore dopo con modifiche successive ogni due o tre giorni.

Discussion

Questo protocollo si basa su modificazioni delle procedure che sono state descritte in passato ^3,7,11. Ci sono diversi punti importanti da notare come descritto di seguito.

I neuroni e le cellule progenitrici dei granuli aderire entro 2 ore dalla placcatura. Le cellule sane hanno una morfologia rotonda sotto il contrasto di fase ⁴ microscopio. Entro 24 ore dopo la placcatura, le cellule sane si diffonderà in modo uniforme in tutto il coprioggetto o il pozzo di plastica e formeranno processi. Al momento del cambio medio prima, dopo 24 ore, ci sarà un paio di cellule morte galleggiante. Questo è normale, come poche cellule moriranno o diventare insalubri durante il processo di dissociazione. Tuttavia, se dopo 48 ore le cellule sono raggruppate con varicosità sui propri processi, sia le cellule sono malsane o il poli-D-lisina substrato è tossico. Come con la maggior parte substrati, l'efficacia di poli-D-lisina è molto dipendente e ogni nuovo lotto deve essere testato. Immagini di culture sano può essere trovato nei riferimenti ^4,11, e ^20. Le cellule sane possono essere mantenute in coltura per un massimo di due settimane ^8.

Progenitori neuronali dei granuli cominciano a differenziarsi sulla placcatura ^8,12,13,14. Una volta che la densità di placcatura ottimale è stabilita per i vostri studi, dovrebbe essere mantenuta, perché la proliferazione è promosso da fattori come segnale di Notch ^15, e le cellule si moltiplicano più alle alte densità. La proliferazione di progenitori neuronali dei granuli possono essere notevolmente prolungata con l'aggiunta di Sonic hedgehog (Shh) al mezzo ^12,13,14. Laminina può anche essere aggiunto come substrato in aggiunta al poli-D-lisina per promuovere crescita dei neuriti ^16,17. Queste caratteristiche della coltura cellulare dei granuli di offrire un sistema per lo studio o la biologia dei neuroni granulari o la regolazione della differenziazione delle cellule progenitrici in neuroni ^6,18,19.

Isolate le cellule del cervelletto di topo postnatale sono inizialmente composto da una miscela di neuroni granulari e progenitori neuronali dei granuli in diverse fasi del ciclo cellulare ^8. Ci sono anche astroglia e interneuroni presenti in isolamento / cultura e ulteriore purificazione dei neuroni dei granuli e progenitori dei granuli (95% -99%) si ottiene la separazione gradiente di Percoll ^4. Granuli arricchita ottenuta senza l'uso del passo separazione gradiente di Percoll sono stati utilizzati per studiare la regolazione della proliferazione e differenziazione dei progenitori neuronali dei granuli, ^18-19-20. In conferma di questo, troviamo che le cellule nella popolazione isolata ignorando il passo gradiente di Percoll separazione rispondere con fermezza a Shh rimanendo nel ciclo cellulare per diversi giorni, e che senza aggiunta Shh, non c'è proliferazione molto poco nelle culture come indicato dalla colorazione con il produttore di proliferazione cellulare, Ki67. Tuttavia, se le culture devono essere utilizzati al di là di alcuni giorni in vitro, si raccomanda che il passo gradiente Percoll essere inclusi per diminuire la contaminazione dei neuroni dei granuli di proliferazione cellule non neuronali.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell strainer with 70μm mesh pore	BD Biosciences	352350
Spinal Needle	BD Biosciences	405182	20G x 3-1/2 inches
Poly-D-Lysine mol wt>300,000	Sigma-Aldrich	P1024	Each new batch of Poly-D-Lysine must be tested.
Percoll	Sigma-Aldrich	P-1644
Penicillin-Streptomycin (100X)	Sigma-Aldrich	P4333
HBSS	Invitrogen	14175-103	Must be calcium and magnesium free.
Neurobasal A-Medium	Invitrogen	10888-022
Glutamax I supplement	Invitrogen	35050-061
B-27 Serum Free Supplement (50x)	Invitrogen	17504-044
12-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3029	These are made in Germany by Deckgluder.
25-mm circle coverslips	Carolina Biological	63-3037	These are made in Germany by Deckgluder.
Papain Dissociation System	Worthington Biochemical	LK 003150	Kit is good for five isolations.
Permaset scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS6782
Dumont #5 (Dumostar)	Roboz Surgical Instruments Co.	RS4978
4-well culture dish	Nalge Nunc international	176740
6-well culture dish	Nalge Nunc international	140685