Overview
출처: 앤드류 J. 반 알스트1,리안논 M. 레베크1,나탈리아 마틴1,빅터 J. 디리타1
1 미생물학 및 분자 유전학학과, 미시간 주립 대학, 이스트 랜싱, 미시간, 미국
성장 곡선은 세균 성장 운동학 및 세포 생리학에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 그들은 우리가 박테리아가 변수 성장 조건에서 반응 하는 방법을 결정 하 고 주어진 된 박테리아에 대 한 최적의 성장 매개 변수를 정의 할 수 있습니다. 고풍스러운 성장 곡선은 지연, 지수, 고정 및 죽음 (1)의 네 단계를 통해 진행됩니다.
그림 1: 세균 성장 곡선. 배치 배양에서 자란 박테리아는 성장의 4 단계를 통해 진행: 지연, 지수, 고정, 그리고 죽음. 지연 단계는 박테리아가 급속한 세포 성장 및 분열을 할 수있는 생리적 상태에 도달하는 데 걸리는 기간입니다. 지수 단계는 DNA 복제, RNA 전사 및 단백질 생산이 모두 일정하고 빠른 속도로 발생하는 가장 빠른 세포 성장 및 분열의 단계입니다. 고정 된 단계 영양소 제한 및/또는 독성 중간 축적으로 인해 세균 성장의 둔화 및 고원을 특징으로합니다. 죽음의 단계는 세포 리시스가 가혹한 양분 제한결과로 생기는 단계입니다.
지연 단계는 박테리아가 급속한 세포 성장 및 분열을 할 수있는 생리적 상태에 도달하는 데 걸리는 기간입니다. 이 지연은 박테리아가 새로운 환경에 적응하는 데 시간이 걸리기 때문에 발생합니다. 필요한 세포 성분이 지연 단계에서 생성되면 박테리아는 DNA 복제, RNA 전사 및 단백질 생산이 모두 일정하고 빠른 속도(2)로 발생하는 기하급수적 성장 단계에 진입합니다. 기하급수상 동안 급속세포 성장 및 분열의 비율은 생성 시간 또는 두 배로 계산되며, 주어진 조건(1)에서 박테리아가 복제할 수 있는 가장 빠른 속도이다. 두 배로 하는 시간은 세균성 성장에 더 유리한 결정하기 위하여 다른 성장 조건을 비교하기 위하여 이용될 수 있습니다. 기하급수학적 성장 단계는 세균세포 생리학이 전체 인구(3)에 걸쳐 일관되기 때문에 가장 재현가능한 성장 상태입니다. 고정 단계는 세포 성장 고원이 있는 기하급수적 단계를 따릅니다. 고정 된 단계는 영양 고갈 및/또는 독성 중간체의 축적으로 인해 가져온다. 세균세포는 복제 및 세포 분열의 비율이 급격히 감소하더라도, 이 단계에서 살아남기 위하여 계속합니다. 마지막 단계는 심각한 영양소 고갈이 세포의 lysing에 이르게 죽음입니다. 가장 많은 정보를 제공하는 성장 곡선의 특징은 지연 단계의 지속 시간, 두 배의 시간 및 도달 한 최대 셀 밀도를 포함한다.
배치 배양에서 박테리아의 정량화는 식민지 형성 단위 와 광학 밀도 측정을 모두 사용하여 결정될 수 있다. 콜로니 성형 유닛(CFU)에 의한 열거는 세균세포 수의 직접적인 측정을 제공한다. CFU에 대한 측정의 표준 단위는 직렬 희석 및 확산 도금 기술에 의해 결정된 배양 (CFU/mL)의 1 mL 당 존재하는 컬터성 박테리아의 수입니다. 각 타임포인트에 대해, 배치 배양의 1:10 희석 계열이 수행되고 각 희석의 100 μl이 셀 스프레더를 사용하여 도금된다.
그림 2. 직렬 희석 도금 회로도. 일괄 처리 문화에서 희석 도금에 대한 일반적인 흐름. 배치 배양은 9ml PBS를 포함하는 후속 튜브로 이전 희석의 1mL을 전송하여 1:10으로 연이어 희석된다. 각 희석 관에서, 100 μl은 CFU/mL을 계산할 때 1mL 부피의1/10제부피이기 때문에 1:10의 추가 희석인 플레이트 스프레더를 사용하여 도금된다. 판은 복제 콜로니가 접시에 자면 배양되고 예매됩니다.
플레이트는 하룻밤 동안 배양되고 복제 식민지가 매립됩니다. 30-300콜로니를 성장시킨 희석 플레이트는 주어진 시점(4, 5)에 대한 CFU/mL을 계산하는 데 사용된다. 30 세 미만의 식민지 수의 스토차스 변화는 CFU / mL의 계산에 더 큰 오차가 적용되며 식민지 혼잡및 겹침으로 인해 300 개 이상의 식민지를 세는 것은 과소 평가 될 수 있습니다. 주어진 플레이트에 대한 희석 계수를 사용하여 배치 배양의 CFU는 각 타임포인트에 대해 계산할 수 있습니다.
광학 밀도는 분광광계를 사용하여 측정된 세균 세포 수의 즉각적인 근사치를 제공합니다. 광학 밀도는 1cm의 배양을 통과하고 포토다이오드 센서(6)에 의해 검출되는 광 입자의 흡수를 측정한 값입니다. 배양물의 광학 밀도는 미디어 블랭크와 관련하여 측정되고 세균밀도가 증가함에 따라 증가합니다. 세균 세포의 경우, 600 nm (OD600)의 파장이 일반적으로 광학 밀도 (4)를 측정 할 때 사용됩니다. 콜로니 성형 유닛 및 광학 밀도와 관련된 표준 곡선을 생성함으로써, 광학 밀도 측정은 배치 배양의 세균 세포 수를 쉽게 근사화하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 이 관계는 세포가 모양을 바꾸고 CFU (7)와 관련되는 광학 밀도 판독에 영향을 미치는 매체에 세포 외 제품을 축적하기 시작으로 0.3 OD600초기에 악화되기 시작합니다. 이 오류는 고정 및 사망 단계에서 더 두드러집니다.
여기서, 대장균은 30시간(7)의 과정을 통해 루리아-베르타니(LB) 국물에서 37°C에서 재배됩니다. CFU/mL 및 광학 밀도 성장 곡선은 CFU에 대한 광학 밀도와 관련된 표준 곡선뿐만 아니라 생성되었습니다.
그림 3. 에체리치아 대장균 광학 밀도 600 nm 파장 (OD600) 성장 곡선. 광학 밀도 값은 멸균 LB 매체로 블랭킹한 후 분광계에서 직접 채취하였다. 1.0보다 큰 OD600 값은 100 μl 배양을 900 μl 의 신선한 LB와 결합하여 1:10을 희석하고, 다시 측정한 다음 10을 곱하여 OD600 값을 얻었다. 이 단계는 분광계의 측정정확도가 높은 세포 밀도에서 감소함에 따라 취해질 것이다. 곡선에서 지연 단계는 약 1h의 성장으로 확장되어 2h에서 7h로 기하급수적 단계로 전환한 다음 고원으로 전환하여 고정 단계에 진입합니다. 그러나 15시간 이후에 광학 밀도가 점차 감소하기 시작하면서 사망 단계는 뚜렷한 전환이 아닙니다.
그림 4. 밀리리터당 대장균 콜로니 형성 유닛(CFU/mL) 성장 곡선. 각 시점에 대한 CFU/mL 값은 30-300개의 콜로니를 포함하는 희석 플레이트로부터 계산되었다. 곡선에서 지연 단계는 약 2시간까지 확장되어 2h에서 7h로 기하급수적인 단계로 전환한 다음 고원으로 전환하여 고정 된 단계로 들어갑니다. 그러나 CFU/mL이 30시간 동안 2 x 109의 피크에서 약 5 x 108로 15시간 후에 점차 감소하기 시작하면서 사망 단계는 뚜렷한 전환이 아닙니다.
그림 5. CFU/mL 대 OD600의 표준화 곡선. 선형 회귀는 광학 밀도가 세균 세포 밀도를 근사화하는 데 사용될 수 있도록 이러한 단위를 관련시키는 데 사용될 수 있다. 광학 밀도는 배치 배양물의 CFU/mL의 즉각적인 근사치를 제공하고 즉시 근사치하는 데 사용될 수 있다. 여기서, OD600과 CFU/mL 사이의 관계가 1.0 OD600을 넘어서는 것이 덜 정확하기 때문에 처음 6개의 타임포인트만이 1.0 OD600에 도달한 직후 박테리아가 고정된 단계에 진입함에 따라 세포 모양과 세포외 제품이 축적되기 시작하면서 플롯된다. 매체의 세포 모양 및 세포외 제품의 변화는 광학 밀도 판독에 영향을 미치므로 광학 밀도와 배양에 있는 박테리아의 수 사이의 관계도 영향을 미칩니다.
두 배의 시간도 15분 19초로 결정되었습니다. 이 데이터에서, 대장균에 대한 LB의 성장 능력은 시각화되고 다른 미디어 또는 박테리아 사이의 비교에 사용될 수 있다.
Procedure
1. 셋업
- 필수 실험실 재료: 액체 매체, 고형화 된 천막 매체, Erlenmeyer 플라스크, 15 mL 테스트 튜브, 인산염 완충식 식염수 (PBS), 세균 세포 스프레더, 70 % 에탄올 및 분광광계. 모든 솔루션과 유리 제품은 사용하기 전에 멸균되어야 합니다.
- 70%의 에탄올로 살균하여 워크스테이션을 준비합니다. 분젠 버너 근처에서 작업하여 미디어 오염을 방지합니다.
- 박테리아와 함께 작업 할 때, 적절한 개인 보호 장비와 무균 기술을 사용해야합니다. 세균 배양과 함께 작업할 때는 실험실 코트와 장갑이 필요합니다.
- 버퍼, 솔루션 및 시약용 레시피
- 인산염 완충식식염(PBS) (8).
- 루리아-베르타니 브로스 (LB) (9).
2. 프로토콜
- 미디어 준비
- 박테리아를 성장 시키고 별도의 자동 분해병에서 액체 국물 및 고체 한천 (1.5 % w /v agar) 미디어를 모두 준비하는 성장 매체를 식별합니다. 여기서, LB 국물과 LB 한청은 대장균의성장을 위해 준비되었다.
- 35분 동안 121°C로 설정된 오토클레이브에서 반조개캡으로 미디어를 살균합니다.
- 한천 의 경우, 오토클레이브 후, 식히기 위해 30 분 동안 50 °C로 설정 된 수조에 놓습니다. 식으면 20-25mL 의 한천 미디어를 100x15mm 원형 페트리 접시에 붓습니다. 플레이트를 사용 하기 전에 실온에서 24 시간 설정 합니다.
- 박테리아의 초기 준비
- 냉동 된 육수에서, 단일 식민지 분리를 얻기 위해 선택 된 미디어 한고에 격리를위한 줄무늬 박테리아. 선택한 박테리아에 허용되는 성장 조건에서 배양하십시오. 여기서, 대장균은 LB 한천에 줄무늬가 있고 하룻밤 사이에 37°C(16-18h)로 배양된다.
- 멸균 접종 루프를 사용하여, 15mL 시험관에서 줄무늬 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 4mL 액체 매체를 접종하고 선택한 박테리아에 허용되는 조건에서 성장한다. 여기서 대장균은 37°C에서 하룻밤 사이에 210rpm(16-18h)에서 흔들리며 재배된다.
- 성장 곡선 설정
- 성장 플라스크 준비
- 오토클레이브 크기의 에를렌마이어 플라스크. 일반적으로 전체 플라스크 볼륨에 대한 미디어의 1:5 비율이 사용됩니다. 여기서, 100 mL LB 미디어는 500 mL 플라스크에 사용된다.
- 세로지학적 파이펫을 사용하여 멸균 매체를 Erlenmeyer 플라스크로 옮기세요.
- 희석 시리즈 준비
- 라벨 15 mL 테스트 튜브: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 및 -9, 각각9mL PBS를 배포. 이 숫자는 CFU/mL을 계산하는 데 사용되는 희석 계수에 해당합니다. 각 수집 타임포인트에는 새로운 튜브 세트가 필요합니다. (그림2)
- 마고 플레이트 준비
- 컬렉션 및 희석 계수의 시간 라벨 플레이트. 각 시간 지점에 대해 각 희석에 대해 하나의 플레이트가 있을 것입니다.
- 성장 플라스크 준비
- 성장 곡선 프로토콜
- 미디어 접종
- 2.2.2단계의 일환으로 준비된 야간 액체 배양을 사용하여 플라스크 미디어를 1:1000 배양으로 접종한다. 여기서, 100 μL 하룻밤 액체 배양은 100mL LB 배지에 첨가된다.
- 박테리아를 균등하게 분배하기 위해 미디어를 소용돌이시다.
- 타임포인트 컬렉션
- 성장 상태 설정
- 주어진 박테리아에 대 한 선택 된 실험 성장 조건에서 플라스크를 배치. 시간 포인트는 빠르게 성장하는 박테리아에 대 한 자주 취해야 하 고 느린 성장 박테리아에 대 한 긴 간격으로 촬영할 수 있습니다. 여기서 대장균은 분당 210회전(rpm)에서 흔들리며 37°C에서 재배되며, 1시간마다 타임포인트가 소요됩니다.
- 광학 밀도(OD600) 측정
- 시작 시점을 포함한 각 시점에서(t = 0) 세균 배양 1mL를 인출하고 분광계 큐벳으로 분배한다.
- 큐벳을 깨끗하게 닦고 600 nm 파장에서 광학 밀도를 기록합니다. 광학 밀도 판독값이 1.0보다 크면 900 μL 프레시 미디어로 1:10 배양 1:10을 희석하고, 광학 밀도를 기록하고, OD600 측정을 위해 이 값을 10으로 곱한다.
- 콜로니 성형 장치(CFU/mL) 측정
- 각 시점에서 세균 배양 1mL를 인출하고 PBS 9mL를 포함하는 -1 유리 시험 관에 분배한다.
- 희석 계열의 경우- -1 튜브에서 1mL를 모든 희석 튜브아래로 -9로 연속적으로 전송하고, 각 전송 후 소용돌이를 한다. (그림2)
- 각 희석에 대해, 그에 상응하는 라벨이 부착된 고체 미디어 천판에 셀 현탁액 100 μL을 분배한다. (그림2)
- 에탄올에서 살균된 셀 스프레더를 사용하여 분젠 버너 불꽃을 통과하고, 한천의 표면을 만져 냉각시키고, 천판표면이 건조해질 때까지 100μL의 셀 서스펜션을 확산한다.
- 박테리아의 성장을 지원하는 온도에서 스프레드 플레이트를 거꾸로 배양합니다. 여기서 대장균은 37°C에서 배양됩니다.
- 인큐베이션 후, 일단 눈에 보이는 식민지가 발생하면 각 판에 세균 성 식민지수를 계산하고 각 시점에서 모든 플레이트에 대한 관련 희석 계수와 함께 이러한 값을 기록합니다.
- 성장 상태 설정
- 미디어 접종
3. 데이터 분석 및 결과
- 광학 밀도(OD600) 성장 곡선 플롯
- 광학 밀도(OD600)와 세미 로그 스케일의 시간을 플롯합니다. (그림3)
- 콜로니 성형 유닛(CFU/mL) 성장 곡선 플롯
- 각 타임포인트에 대해, 식민지 수가 30-300 박테리아의 범위 내에 떨어졌다 희석 판을 선택합니다. 콜로니 카운트 수를 희석 계수별로 곱한 다음 100 μL 스프레드가 CFU/mL을 계산할 때 추가1:10 희석으로 간주됩니다.
- 콜로니 형성 유닛과 시간 대 반로그 스케일을 플롯합니다. (그림4)
- 각 타임포인트에 대해, 식민지 수가 30-300 박테리아의 범위 내에 떨어졌다 희석 판을 선택합니다. 콜로니 카운트 수를 희석 계수별로 곱한 다음 100 μL 스프레드가 CFU/mL을 계산할 때 추가1:10 희석으로 간주됩니다.
- 광학 밀도 및 식민지 형성 장치 관련
- OD600과 CFU/mL 사이의 관계가 1.0 OD600을 초과하여 덜 정확하기 때문에 OD600 판독값에 대한 선형 축척에서 콜로니 형성 유닛과 광학 밀도를 1.0 OD600 이상으로 플롯한다. 여기서 처음 여섯 개의 타임포인트가 플롯됩니다. (그림5)
- 방정식과 R2 값을 표시하는 선형 회귀 추세선을 생성합니다.
- 박테리아 두 배 시간 결정
- 콜로니 형성 단위 성장 곡선 플롯을 사용하여, 기하급수적 단계 동안, 두 배의 시간을 계산하기 위해 그들 사이의 가파른 경사와 그래프에 두 점을 식별합니다.
- 두 배로 계산
- ΔTime = t2 - t1,여기서 t1 = 타임 포인트 1 및 t2 = 시간 점 2
-
, 여기서 b = t2, B = 세대의 n = 수의 박테리아 수에서 박테리아의 수. 에서 파생 : .
- 다음을 사용하여 두 배의 시간을 계산합니다.
, 여기서 b = t2, B = 세대의 n = 수의 박테리아 수에서 박테리아의 수. 에서 파생 : 박테리아는 세포 분열에게 불린 프로세스를 통해 재생합니다, 2개의 동일 한 딸 세포 결과. 성장 조건이 유리한 경우에, 세균성 인구는 기하급수적으로 증가할 것입니다.
세균성장 곡선은 시간의 함수로서 배양에서 박테리아의 양을 플롯한다. 일반적인 성장 곡선은 지연 단계, 지수 단계, 고정 된 위상 및 사망 단계의 네 단계를 통해 진행됩니다. 지연 단계는 박테리아가 성장하고 빨리 분할 할 수있는 상태에 도달하는 데 걸리는 시간입니다. 그 후, 박테리아는 급속한 세포 성장 및 분열을 특징으로 하는 기하급수적 단계로 전이한다. 이 단계 동안 세균 배양의 기하급수적 성장 속도는 박테리아가 특정 조건하에서 재현할 수 있는 가장 빠른 속도인 두 배로 표현될 수 있다. 고정 된 단계는 다음 온다, 어디 세균성 세포 성장 고원 및 성장 및 죽음 속도 환경 영양소 고갈로 인해 밖으로 도 밖으로. 마지막으로 박테리아는 사망 단계에 들어갑니다. 이것은 세균성 성장이 급격하게 감소하고 가혹한 양분 고갈이 세포의 lysing에 이끌어 내는 곳입니다.
두 가지 기술은 배양에 존재하는 박테리아의 양을 정량화하고 성장 곡선을 플롯하는 데 사용될 수 있다. 이들 중 첫 번째는 식민지 형성 단위, 또는 CfU를 통해. CfUs를 얻으려면 일반 시점에서 1~10개의 희석시리즈가 수행됩니다. 이러한 희석의 첫 번째, 이 예에서 부정적인 하나, PBS의 9mL 및 세균 배양의 1mL를 포함. 1:10 희석 계수의 결과. 그런 다음, 이 용액의 1mL은 다음 튜브, 음수 2로 옮겨져 1:100 희석 계수의 결과이다. 이 과정은 마지막 튜브, 네거티브 아홉을 통해 계속되어 최종 희석 계수인 11억 입니다. 그 후 각 희석제의 100마이크로리터가 도금됩니다. 그런 다음 플레이트가 배양되고 복제 콜로니가 계산됩니다. 30~300개의 콜로니 사이로 자라는 주어진 시간지점에 대한 희석 플레이트는 해당 시점당 밀리리터당 CFU를 계산하는 데 사용됩니다.
세균 농도를 측정하는 두 번째 일반적인 방법은 광학 밀도입니다. 배양물의 광학 밀도는 분광광계와 함께 미디어 블랭크와 관련하여 즉시 측정할 수 있습니다. 전형적으로 OD600이라고도 하는 600 나노미터의 파길이는 세포 밀도가 증가함에 따라 증가하는 이러한 측정에 사용된다. 광학 밀도는 CfU보다 덜 정확하지만 즉시 얻을 수 있으며 시약이 상대적으로 적기 때문에 편리합니다. 두 기술은 함께 사용하여 배양물의 세균 세포 수에 보다 정확하게 근사하는 표준 곡선을 만들 수 있습니다. 이 비디오에서는 대장균의시간 제1류 희석에서 CFU 및 OD600 측정값을 얻는 방법을 배웁니다. 그런 다음 CFU 및 OD600 측정을 사용하는 두 개의 성장 곡선이 각각 표준 곡선에 의해 관련되기 전에 플롯됩니다.
박테리아와 함께 작업 할 때, 실험실 코트와 장갑과 같은 적절한 개인 보호 장비를 사용하고 적절한 무균 기술을 관찰하는 것이 중요합니다.
그 후, 70%의 에탄올로 워크스테이션을 살균한다. 먼저 LB 국물 및 LB 고체 천 미디어를 별도의 자동 복제 가능한 병에 준비합니다. 병의 캡을 부분적으로 닫은 후 35 분 동안 섭씨 121도로 설정된 오토 클레이브에서 미디어를 소독하십시오. 다음으로, 한천 매체가 섭씨 50도까지 30분 동안 정해져 있는 수조에서 식을 수 있도록 합니다. 식으면 각 페트리 접시에 20~25mL를 붓습니다. 그 후, 플레이트가 실온에서 24시간 동안 설정되도록 합니다.
나중에 액체 세균 문화를 생산하는 데 사용되는 단일 식민지 격리를 준비하려면 이전에 냉동 된 재고와 적절한 줄무늬 도금 기술을 사용하여 LB 한천에서 격리하기 위해 대장균을 줄입니다. 하룻밤 사이에 37도에서 요리를 배양하십시오. 그 후, 줄무늬 플레이트에서 단일 식민지를 선택하기 전에 한천에 화염 살균 접종 루프를 식히십시오. 15 mL 시험관에서 액체 매체의 4mL접종. 그런 다음, 210 rpm에서 흔들어 하룻밤 37섭씨에서 대장균을 성장시다.
성장 곡선에 사용될 1:1000 부피를 설정하려면 먼저 500mL 에렌마이어 플라스크를 자동 으로 획득하십시오. 이어서, 50mL 세로지학적 파이펫을 사용하여 멸균 매체100mL을 플라스크로 이송한다. 다음으로, 9 개의 15ml 테스트 튜브를 연속적으로 1~9개로 레이블을 지정합니다. 이 숫자는 콜로니 형성 유닛 또는 CFU를 계산하는 데 사용되는 희석 계수에 해당합니다. 그런 다음 각 튜브에 1X PBS9mL을 추가합니다. 그런 다음 준비된 한천 플레이트에 해당 시간 점 및 희석 인자와 라벨을 부착하여 재배합니다. 대장균을가진 이 예에서는 시작 시점 이후에 시간 포인트가 매시간 한 번씩 취합니다. 이전에 준비된 야간 액체 대장균 배양을 사용하여, 1:1000량의 문화로 오토클레이브 500 mL Erlenmeyer 플라스크에서 미디어를 접종한다. 박테리아를 균등하게 분배하기 위해 미디어를 소용돌이시다.
분광계를 블랭크한 후, 큐벳을 보풀이 없는 닦아냅니다. 다음으로, 배양1mL을 큐벳에 분배하고 분광계에 배치하여 시점 0시 배양물의 광학 밀도를 얻습니다. 그런 다음 210 rpm에서 흔들리면서 대장균을 섭씨 37도에서 자랍니다. 정시 점 0 이후의 시점에서 플라스크에서 세균 배양의 또 다른 1 mL을 철회하고 광학 밀도 측정을 반복한다. 광학 밀도 판독값이 1.0보다 크면 900마이크로리터의 신선한 배지로 세균 배양 100마이크로리터를 희석한 다음 광학 밀도를 다시 한 번 측정합니다. 이 값은 OD 600 측정에 대해 10을 곱할 수 있습니다.
매 시점에 대한 콜로니 형성 단위 측정을 얻으려면, 매 시 지점에서 플라스크로부터 세균 배양1mL를 추가로 인출한다. 세균 배양을 부정적인 하나의 테스트 튜브와 소용돌이에 분배하여 혼합합니다. 이어서, 먼저 음의 한 튜브로부터 1mL를 음의 2개의 튜브와 소용돌이로 이체하여 희석 계열을 수행하여 혼합한다. 음의 2개의 튜브에서 1mL를 음의 3개의 튜브와 소용돌이로 전달하여 혼합합니다. 이 직렬 전송을 계속하여 모든 희석 튜브를 음의 9 튜브로 옮기십시오. 각 희석에 대해 해당로 표지된 플레이트에 셀 서스펜션 100마이크로리터를 분배합니다. 모든 희석을 위해 에탄올의 셀 스프레더를 살균하고 분젠 버너 불꽃을 통과하고 무접종으로부터 한천의 표면을 만져 식힙니다. 그런 다음, 세포 스프레더를 사용하여 천판의 표면이 건조해질 때까지 세포 현탁액을 퍼뜨리십시오. 37°C에서 접시를 거꾸로 배양합니다. 눈에 보이는 식민지가 발생하면 각 판에 세균성 식민지수를 계산합니다. 각 시간 지점에서 각 플레이트에 대해 이러한 값과 관련 희석 계수를 기록합니다.
OD 600 성장 곡선을 만들려면 모든 데이터 요소가 테이블에 올바르게 입력되도록 한 후 모든 시간 점과 해당 데이터를 선택합니다. 콜로니 형성 단위 성장 곡선 플롯을 생성하려면, 식민지 수가 각 시간 지점에 대해 30 내지 300 박테리아 범위 내에 떨어진 희석 판을 선택합니다. 콜로니 카운트 수를 희석 계수로 곱한 다음 10개씩 곱합니다. 이는 100 마이크로리터 스프레드가 밀리리터당 콜로니 형성 유닛을 계산할 때 추가1:10 희석으로 간주되기 때문이다. 이 후, 반로그 스케일에 시간 대 식민지 형성 단위를 플롯.
OD 600 및 CFU 측정으로 생성된 이러한 플롯은 각각 대장균 성장 운동학에 대한 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 광학 밀도 및 식민지 형성 유닛은 OD 600 측정에서 밀리리터당 CFU를 추정할 수 있으므로 향후 실험에서 시간과 재료를 절약할 수 있습니다.
이렇게 하려면, ODI 600 판독값에 대한 선형 축척에 대한 광학 밀도에 대하여 콜로니 형성 유닛을 1 이하로 또는 같을 수 있도록 플롯한다. 0. 그 후, M이 경사이고 B가 y-intercept인 Y = MX + B 형식으로 선형 회귀 추세선을 생성합니다. 데이터 포인트를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 추세선 및 선형 추가를 선택합니다. 그런 다음 상자를 선택하여 차트에 방정식을 표시하고 차트에 R 제곱 값을 표시합니다. R 제곱 값은 데이터가 장착된 회귀 라인과 얼마나 밀접하게 일치하는지에 대한 통계 적 측정입니다. 이 예제에서는 처음 6시간 포인트가 x 축에 OD 600, y 축의 밀리리터당 CFU로 플로팅됩니다. 향후 동일한 성장 조건을 가진 실험에서 이러한 경사 및 y-가로채기 값을 이 방정식에 연결하여 OD 600 판독값에서 CFO를 추정할 수 있습니다. 다음으로, 식민지 형성 단위 성장 곡선 플롯을 살펴보십시오. 기하급수 적 단계에서 두 시간 지점을 식별하여 둘 사이의 가장 가파른 경사면을 확인합니다. 두 배로 계산하려면 먼저 선택한 시간 점 사이의 시간 변화를 계산합니다. 그런 다음 여기에 표시된 방정식을 사용하여 세대의 변화를 계산합니다. 여기서, 소문자 b는 시점에서 세균의 수가 3및 상류케이스 B는 시점 2시에 박테리아의 수이다. 마지막으로, 시대의 변화를 세대의 변화로 나눕니다. 이 예제에서는 두 배로 증가하는 시간이 0입니다. 26시간 15분 19초. 다른 실험 적인 치료에 걸쳐 두 배로 시간을 비교 하면 특정 세균 성 종에 대 한 최고의 성장 조건을 식별 할 수 있습니다. 따라서, 가장 낮은 두 배로 치료하는 것은 테스트 된 조건의 가장 최적일 것이다.
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Results
식민지 형성 단위 및 광학 밀도의 플롯은 성장 운동학을 시각화하는 두 가지 방법입니다. CFU/mL과 OD600 사이의 관계를 결정함으로써 광학 밀도 플롯은 시간이 지남에 따라 CFU/mL의 추정치를 제공합니다. 가장 짧은 두 배로 시간을 초래하는 조건은 주어진 박테리아의 성장에 최적으로 간주됩니다.
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Applications and Summary
성장 곡선은 박테리아의 성장 운동 및 생리학을 이해하는 데 유용합니다. 그들은 우리가 박테리아가 가변 성장 조건에서 어떻게 반응하는지 결정하고 주어진 박테리아에 대한 최적의 성장 매개 변수를 정의 할 수 있습니다. 콜로니 형성 장치 와 광학 밀도 플롯 모두 지연 단계의 지속 시간을 묘사 하는 귀중 한 정보를 포함, 최대 세포 밀도 도달, 세균성 두 배 시간의 계산에 대 한 허용. 성장 곡선은 또한 동일한 성장 조건 하에서 다른 박테리아 사이 비교를 허용 합니다. 또한 광학 밀도는 초기 접종을 표준화하여 다른 실험의 일관성을 향상시킵니다.
성장 곡선 실험을 설계할 때 사용할 방법을 결정하려면 고려해야 합니다. 성장 곡선을 생성하는 데 바람직한 방법으로, 콜로니 형성 단위 플롯은 배치 배양에서 실행 가능한 세포 수를 보다 정확하게 반영한다. 콜로니 형성 단위 플롯은 또한 그렇지 않으면 광학 밀도 측정을 방해 할 조건에서 세균 성장을 측정 할 수 있습니다. 그러나 시약의 광범위한 사용을 요구하는 시간이 많이 소요되는 프로세스이며 수동으로 수행해야 합니다. 광학 밀도 플롯은 덜 정확하고 식민지 형성 단위의 추정만제공하므로 각 고유 박테리아에 대해 표준 곡선을 생성해야 합니다. 광학 밀도는 주로 훨씬 적은 시간 소모이며 수행하기 위해 많은 시약을 필요로하지 않기 때문에 편의를 위해 주로 사용됩니다. 광학 밀도에 가장 매력적인 것은 분광성 인큐베이터가 자동으로 성장 곡선을 생성하여 한 번에 테스트할 수 있는 배양 조건의 수를 크게 늘리고 지속적으로 문화에 참여할 필요가 없다는 것입니다.
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