Dissecção de túbulo malpighiano de uma mosca adulta: isolando um órgão osmoregulatório e excretório

- Comece com uma mosca adulta anestesiada em um prato de dissecação. Segure a mosca pelo tórax com fórceps e abra a extremidade posterior do abdômen usando um segundo par de fórceps. Uma vez que as moscas adultas têm dois pares de túbulos malpighianos ou MTs que convergem para o intestino através de ureteres comuns, puxe o intestino traseiro para fora da mosca para liberar os MTs. O par posterior de TM será libertado primeiro enquanto eles circundam atrás do intestino.

Para montar os túbulos, deslize uma haste de vidro sob o ureter e transfira os MTs para o slide revestido de poli-L-lysine. Afixe os órgãos dissecados pressionando o ureter para baixo e, em seguida, varrer cuidadosamente a haste sobre os MTs. A poli-L-lysine no slide promoverá o apego aumentando o número de locais carregados positivamente disponíveis para as células negativamente carregadas das banheiras para amarrar. No protocolo a seguir, vamos dissecar MTs de uma mosca fêmea adulta e montá-los para imagens ao vivo ex vivo em um sistema de perfusão.

- Para iniciar este procedimento, posicione dois conjuntos de solda ajudando as mãos a fixar as mãos no estágio do microscópio de imagem com um grampo em cada lado. Em seguida, insira os respectivos capilares de vidro dobrado na linha de entrada e a linha de saída conectada ao vácuo. Em seguida, monte-os nas mãos auxiliares.

Espalhe a graxa de vácuo na fita do teto e pressione o divisor de perfusão adesivo sobre a fita para revestir a parte inferior com graxa. Retire o divisor de poços de perfusão adesivo e coloque-o lado para baixo em cima de um slide revestido de poli-L-lysina. Depois disso, remova o divisor de poços de perfusão para deixar poços de espécimes individuais traçados em graxa hidrofóbica. Depois disso, coloque 200 microlitros de iPBS de temperatura ambiente ou salina tampão fosfato de inseto no prato de disseminação de graxas bem envolto no slide poli-L-lysine revestido. Em seguida, coloque o slide sob o estereoscópio, despeje gelo frio Schneider meio no prato de disseminação do tado, e transferir uma única fêmea anestesiada voar para ele.

Segure a mosca pelo tórax com o conjunto de fórceps e use o outro para segurar suavemente o abdômen posterior. Abra a extremidade posterior da mosca em movimentos curtos e deliberados. Uma vez que o intestino traseiro seja visível, segure a extremidade distal e liberte o intestino e os MTs das traqueais subjacentes puxando o intestino traseiro para longe do corpo através de puxões repetitivos e breves.

Em seguida, belisque os MTs internos no ureter com fórceps finos uma vez que o segundo conjunto de MTs esteja livre do abdômen. Pegue os MTs anteriores livres com a haste de vidro puxado deslizando a haste sob o ureter de tal forma que os túbulos caem para ambos os lados. Depois disso, levante os MTs direto para fora da solução.

Abaixe o ureter direto para baixo na lâmina. Em seguida, afixe a ordem e o selo da lente distal dos MTs pressionando ainda mais o ureter sobre a lâmina de vidro. Use a extremidade fina da haste de vidro para varrer suavemente cada túbulo através da superfície do slide. Prepare a haste contra o slide para evitar esmagar o túbulo e deslize a haste sobre a parte superior do túbulo, movendo-se de distal para proximal para anexar o comprimento total de cada túbulo à superfície do slide poli-L-lysine revestido.

- O sucesso desta técnica depende inteiramente da identificação precisa e do manuseio cuidadoso dos túbulos malpighianos anteriores. Os túbulos danificados produzirão resultados inconsistentes.

- Em seguida, coloque o divisor de poços de perfusão adesivo de volta no slide para formar um pequeno fluido bem preenchido sobre o túbulo montado. Depois disso, coloque a amostra no estágio do microscópio. Posicione os capilares de entrada e saída sobre a entrada e abertura de saída do poço de perfusão, respectivamente.