Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Placera embryon av intresse i fenyltiourea, PTU, Ringers lösning för att hämma pigmentbildningen, som börjar vid 24 timmar efter befruktning.
Ta en före-bild av webbplatsen. visa axonen med en 910 nanometer laser som gör att GFP fluorescerar rött. Öka intensiteten hos denna laser för att skada målområdet utan att påverka den omgivande vävnaden.
- Om ett specialbyggt tvåfotonsikte inte finns tillgängligt i ditt laboratorium kan Zeiss 510 konfokalt tvåfotonmikroskop också användas för att bryta axoner.
Även om båda lasrarna används för att upptäcka GFP, visualiseras de två fotonutsläppen med rött och argonlaserutsläppet med grönt för att differentiera de två. Använd argonlasern för att identifiera en axon för att skada. Under Z-inställningar markera den första och sista optiska sektionen, ta en konfokal bild och skapa en maximal projektion av Z-stacken.
Stäng av argonlasern och slå på de två fotonlasern. Scan med en intensitet på ca 9% transmission för att se till att axon fortfarande är i fokus. Klicka på stoppknappen så att Crop-verktyget kommer att vara tillgängligt. Använd Crop för att zooma in på intresseområdet. Vanligtvis zoomar vi till ca 70x. Välj den region i axonen som ska skadas och sätt denna region i fokus. Zoomen kan kontrolleras under fliken Läge.
Därefter, under fliken Kanaler, ändra intensiteten hos de två fotonerna från ca 9% överföring till 15% till 30% överföring. För att aktivera de nya inställningarna, klicka på Fast XY-knappen och klicka sedan på Stoppa snabbt efteråt för att undvika överskjutande skador. Axon ska ses som spridda skräp om proceduren fungerade. Slutligen, för att säkerställa att axon verkligen skadades, växla tillbaka till 488 nanometer argon laser.
