Overview
I pesci zebra (Danio rerio) sono un importante organismo modello che è particolarmente prezioso per la ricerca in biologia dello sviluppo. I pesci zebra sono estremamente fertili e possono produrre centinaia di progenie a settimana, quindi è relativamente facile raccogliere un gran numero di embrioni per un numero elevato di campioni. Inoltre, i pesci zebra subiscono un rapido sviluppo e gli embrioni sono trasparenti, consentendo una facile visualizzazione dei processi di sviluppo.
Questo video illustra i passaggi necessari per la raccolta di embrioni di zebrafish appena fecondati. Viene presentata una breve panoramica del comportamento di accoppiamento dei pesci zebra, seguita dalle istruzioni per l'creazione di incroci in vasche di allevamento di laboratorio specializzate che consentono l'accoppiamento controllato. Sono inoltre coperte le condizioni necessarie per avviare il rilascio delle uova (noto come deposizione delle uova) la mattina dopo l'installazione dei serbatoi. Successivamente, vengono presentate tecniche essenziali per lavorare con gli embrioni, tra cui l'inibizione dello sviluppo del pigmento con la PTU chimica e la decorionazione: una procedura in cui viene rimossa la membrana simile a un guscio che circonda l'embrione (il corion). Infine, il video si conclude con alcune applicazioni pratiche di queste tecniche nella ricerca sullo sviluppo.
Procedure
Zebrafish è un piccolo ma potente sistema di modelli. Questi pesci prolifici possono generare centinaia di prole a settimana e molte migliaia nel corso della loro vita. Il rapido sviluppo esterno e i corpi trasparenti rendono gli embrioni ideali per diverse applicazioni. Questo video coprirà le basi della raccolta e della gestione degli embrioni prima di descrivere gli attuali metodi di ricerca che sfruttano gli embrioni di zebrafish.
Per generare embrioni, aiuta a conoscere un po 'il comportamento di accoppiamento del pesce zebra.
Il pesce zebra subisce la riproduzione sessuale, quindi l'allevamento richiede sia pesci maschi che femmine. I maschi hanno corpi più sottili con una tonalità leggermente rossa, mentre le femmine hanno pance più grandi e argentate piene di uova.
L'accoppiamento periodico mantiene le uova sane, ma fare tutte quelle uova richiede molto lavoro, quindi le singole femmine dovrebbero essere accoppiate solo una volta alla settimana.
Infine, come molti altri animali, i processi sensoriali guidano il comportamento di accoppiamento nei pesci.
I segnali olfattivi del maschio aiutano a preparare la sua amica a deporre le uova, mentre un po 'di illuminazione d'atmosfera li mette entrambi in azione.
Avendo imparato a identificare pesci maschi e femmine, è tempo di impostare una croce.
Per l'allevamento di pesci zebra, i ricercatori utilizzano vasche specificamente progettate per l'accoppiamento. Le vasche di riproduzione in genere presentano un inserto rimovibile con fori che consentono alle uova di cadere. Questa caratteristica protegge le uova dall'essere mangiate da pesci adulti affamati.
Per iniziare, combina pesci adulti in vasche di riproduzione durante il pomeriggio o la sera. Per raccogliere embrioni in fase iniziale la mattina seguente, separa i pesci maschi e femmine con un divisore, che impedisce loro di riprodursi prima di essere pronti per iniziare un esperimento. Per evitare che il pesce salti fuori, assicurati di coprire il serbatoio di riproduzione con un coperchio. Quindi, lascia che i pesci si acclimatino l'un l'altro durante la notte.
Dopo aver trascorso la notte insieme in una vasca di riproduzione, il pesce si accoppia la mattina seguente.
Il primo passo al mattino è rimuovere il divisorio tra il pesce maschio e femmina per iniziare la deposizione delle uova. Se non viene utilizzato un divisorio, il pesce deposterà le uova poco dopo l'inizio della luce.
Mentre i maschi inseguono le femmine intorno al serbatoio, stimolano la deposizione delle uova mentre rilasciano lo sperma nell'acqua per la fecondazione. Attendere circa 15 - 30 minuti dopo aver tirato un divisorio per dare al pesce il tempo di accoppiarsi. Quindi, rimuovere gli adulti dal serbatoio utilizzando una rete o sollevando l'inserto del serbatoio e posizionando il pesce in un altro acquario.
Quindi, versare l'acqua e gli embrioni attraverso un colino da tè a rete per la raccolta. Quindi, usando "acqua d'uovo", lavare gli embrioni dal colino in una capsula di Petri. Potrebbe essere necessario trasferire embrioni tra i piatti per ottenere una densità ottimale di 50 - 100 per piatto. Per garantire che lo sviluppo proceda a un ritmo normale, posizionare i piatti in un'incubatrice a 28,5 °C.
Una volta che hai i tuoi embrioni, gestiscili con cura. Sono importanti per i tuoi esperimenti! Esaminiamo alcuni suggerimenti.
Per mantenere gli embrioni sani, assicurati di mantenere l'acqua nelle piastre di Petri pulita e priva di detriti. Gli embrioni morti saranno opachi e dovrebbero essere rimossi ogni giorno. Inoltre, il blu di metilene può essere aggiunto all'acqua per prevenire la crescita dei funghi.
Ogni volta che è necessario spostare gli embrioni da un piatto all'altro, utilizzare una pipetta di trasferimento. Facendo roteare il piatto, puoi concentrare gli embrioni al centro del piatto, rendendo più facile il pipettaggio.
Alcuni protocolli richiedono alcuni passaggi aggiuntivi per il mantenimento dell'embrione. Per i primi tre giorni di vita, gli embrioni di zebrafish si sviluppano all'interno di un corion, che può impedire la manipolazione dell'embrione. Il corion può essere rimosso mediante trattamento con l'enzima proteolitico, pronasi, o utilizzando una pinna per rimuoverlo manualmente. Inoltre, il pesce zebra inizia a sviluppare il pigmento entro 24 ore, come mostrato qui in questa larva di zebrafish, che può interferire con la microscopia. Per vedere attraverso questo problema, gli scienziati integrano l'acqua dell'embrione con PTU, che inibisce la produzione del pigmento melanina.
Ora che sai come ottenere e prendersi cura degli embrioni di zebrafish, esploriamo alcuni dei modi in cui i ricercatori li usano per la scoperta scientifica.
Lo sviluppo esterno di embrioni di zebrafish consente la manipolazione genetica mediante microiniezione di DNA, RNA o reagenti di knockdown genico. Questo metodo porta a una distribuzione uniforme del materiale iniettato in tutto l'embrione e può produrre fenotipi visibili derivanti dalla sovraespressione o dalla perdita di una proteina. La stessa tecnica può essere utilizzata anche per realizzare pesci transgenici in cui strutture specifiche sono caratterizzate dall'espressione di proteine fluorescenti.
Inoltre, le piccole dimensioni degli embrioni e delle larve di zebrafish li rendono ideali per lo screening chimico fenotipico. Qui, gli embrioni vengono caricati in piastre a 96 pozzetti e poi trattati con librerie di piccole molecole aggiungendo le sostanze chimiche nell'acqua. Successivamente, queste piastre di pesce vengono sottoposte a screening per difetti morfologici, come lo sviluppo anormale mostrato qui.
Infine, la trasparenza degli embrioni di zebrafish li rende adatti per la microscopia. Gli embrioni vivi che esprimono proteine fluorescenti in specifici tipi di cellule possono essere montati e visualizzati con la microscopia confocale, consentendo ai ricercatori di esaminare i movimenti cellulari nei tessuti in via di sviluppo nel tempo.
Hai appena visto il video di JoVE sull'allevamento di pesci zebra e sulla gestione degli embrioni. In questo video, abbiamo discusso le basi dell'accoppiamento, la creazione di vasche di riproduzione e la gestione degli embrioni. Abbiamo anche discusso alcuni metodi di ricerca che sfruttano questo piccolo embrione potente. Grazie per l'attenzione!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
