Overview
La dialisi è una tecnica comune utilizzata in biochimica per separare le molecole in base alla diffusione. In questa procedura, una membrana semipermeabile consente il movimento di determinate molecole in base alle dimensioni. Questo metodo può essere applicato alla rimozione del tampone, noto come desalazione, o allo scambio di molecole tampone o ioni da una soluzione proteica.
Questo video copre i principi della dialisi insieme a una procedura generale. Vengono esaminate diverse applicazioni della dialisi, tra cui la rimozione dei reagenti gradienti dopo ultracentrifugazione, la rimozione del detergente dopo un'estrazione di proteine di membrana e la ricostituzione delle proteine modificando l'ambiente della soluzione.
I campioni biochimici hanno in genere alte concentrazioni tampone che possono interrompere l'elaborazione e l'analisi a valle. La dialisi è una tecnica comune ed economica utilizzata per separare le molecole in base alla diffusione. Il metodo utilizza una membrana semipermeabile che consente il movimento di determinati componenti, in base alle dimensioni. Questo video mostrerà i concetti di dialisi, una procedura generale e alcuni dei suoi usi in biochimica.
L'aspetto più importante della dialisi è una membrana semipermeabile, che ha pori che impongono un taglio di peso molecolare, consentendo il passaggio di molecole al di sotto di una certa dimensione. Ad esempio, una membrana 10k generalmente trattiene molecole più grandi di 10 kilodalton. Tuttavia, il taglio del peso molecolare non è un confine discreto o preciso. La membrana contiene tipicamente una vasta gamma di dimensioni dei pori, quindi una piccola frazione di molecole vicino al cutoff può essere persa.
Poiché il taglio del peso molecolare è definito utilizzando proteine globulari, molecole lineari di massa simile, come DNA o RNA, possono scivolare attraverso. Le membrane sono tipicamente scelte da mezzo a un terzo del peso molecolare della molecola desiderata.
Per eseguire la procedura, un campione viene inserito nella membrana, che a sua volta viene aggiunto a un grande volume di soluzione, chiamato dialisi. Nel corso del tempo, le molecole più piccole si diffonderanno liberamente attraverso la membrana tra il campione e il dialisato, mentre le biomolecole più grandi sono tenute all'interno. La dialisi è un processo lento. È comune consentirne l'esecuzione durante la notte o anche per più giorni.
Se il dialisato è acqua pura, la concentrazione complessiva del tampone diminuirà, un processo noto come dissalato. Se la soluzione contiene altre piccole particelle, alcune si sposteranno nel campione, portando allo scambio di buffer. Poiché la dialisi è un processo di equilibrio, il dialisiato può essere aggiornato più volte per spostare ulteriormente piccole molecole. Una volta completato il processo, il campione viene nuovamente raccolto per un'ulteriore elaborazione.
Ora che hai visto le basi della dialisi, diamo un'occhiata a una procedura generale.
Prima di iniziare la procedura, la membrana viene presata in dialisi. Questo lo rende più facile da usare e rimuove eventuali conservanti. Una volta pronto, il campione viene raccolto, in genere con una siringa e quindi aggiunto al contenitore per dialisi. Questo può essere un tubo nudo o contenuto all'interno di una cassetta. L'aria in eccesso viene rimossa dalla configurazione di dialisi per massimizzare la superficie del campione con la membrana. L'impostazione viene quindi posizionata nel dialisi con agitazione per massimizzare la diffusione. Dovrebbe galleggiare per non inibire l'agitazione.
Il dialisi viene modificato a intervalli rilevanti al raggiungimento dell'equilibrio tra campione e dialisi. Dopo l'ultimo cambiamento, la reazione viene in genere lasciata correre durante la notte. Dopo un periodo di tempo sufficiente, il campione privo di buffer o scambiato viene rimosso dalla cassetta. Una volta raccolto, il campione può essere analizzato o ulteriormente elaborato, a seconda della natura dell'esperimento.
Ora che abbiamo esaminato una procedura di dialisi generale, vediamo alcuni dei modi in cui questa tecnica viene utilizzata in biochimica.
I gradienti di densità sono un modo comune per separare campioni biologici complessi. Questo concetto si basa sulla distribuzione su piccole particelle, tipicamente ioni saccarosio o cloruro di cesio. Una volta completati, questi reagenti in genere devono essere rimossi prima che il campione raccolto possa essere elaborato. La dialisi consente di utilizzare il campione purificato per analisi future.
Alcune proteine si trovano all'interno del doppio strato lipidico di una cellula e di solito sono studiate intervallandole in vescicole lipidiche sferiche note come liposomi. Le proteine e i lipidi vengono prima estratti con un detergente. La dialisi può essere utilizzata per rimuovere lentamente il detergente, formando proteolipolismi.
Dopo la purificazione, alcune proteine vengono mal ripiegate o denaturate, portando a una perdita di funzionalità. I composti che causano questi cambiamenti nella struttura possono essere rimossi con la dialisi, portando alla riforma degli analiti funzionanti.
Hai appena visto il video di JoVE sulla dialisi. Ora dovresti capire questo metodo basato sulla diffusione, una semplice procedura sperimentale e l'uso di questa tecnica.
Grazie per l'attenzione!
Procedure
La dialisi è una tecnica comune utilizzata in biochimica per separare le molecole in base alla diffusione. In questa procedura, una membrana semipermeabile consente il movimento di determinate molecole in base alle dimensioni. Questo metodo può essere applicato alla rimozione del tampone, noto come desalazione, o allo scambio di molecole tampone o ioni da una soluzione proteica.
Questo video copre i principi della dialisi insieme a una procedura generale. Vengono esaminate diverse applicazioni della dialisi, tra cui la rimozione dei reagenti gradienti dopo ultracentrifugazione, la rimozione del detergente dopo un'estrazione di proteine di membrana e la ricostituzione delle proteine modificando l'ambiente della soluzione.
I campioni biochimici hanno in genere alte concentrazioni tampone che possono interrompere l'elaborazione e l'analisi a valle. La dialisi è una tecnica comune ed economica utilizzata per separare le molecole in base alla diffusione. Il metodo utilizza una membrana semipermeabile che consente il movimento di determinati componenti, in base alle dimensioni. Questo video mostrerà i concetti di dialisi, una procedura generale e alcuni dei suoi usi in biochimica.
L'aspetto più importante della dialisi è una membrana semipermeabile, che ha pori che impongono un taglio di peso molecolare, consentendo il passaggio di molecole al di sotto di una certa dimensione. Ad esempio, una membrana 10k generalmente trattiene molecole più grandi di 10 kilodalton. Tuttavia, il taglio del peso molecolare non è un confine discreto o preciso. La membrana contiene tipicamente una vasta gamma di dimensioni dei pori, quindi una piccola frazione di molecole vicino al cutoff può essere persa.
Poiché il taglio del peso molecolare è definito utilizzando proteine globulari, molecole lineari di massa simile, come DNA o RNA, possono scivolare attraverso. Le membrane sono tipicamente scelte da mezzo a un terzo del peso molecolare della molecola desiderata.
Per eseguire la procedura, un campione viene inserito nella membrana, che a sua volta viene aggiunto a un grande volume di soluzione, chiamato dialisi. Nel corso del tempo, le molecole più piccole si diffonderanno liberamente attraverso la membrana tra il campione e il dialisato, mentre le biomolecole più grandi sono tenute all'interno. La dialisi è un processo lento. È comune consentirne l'esecuzione durante la notte o anche per più giorni.
Se il dialisato è acqua pura, la concentrazione complessiva del tampone diminuirà, un processo noto come dissalato. Se la soluzione contiene altre piccole particelle, alcune si sposteranno nel campione, portando allo scambio di buffer. Poiché la dialisi è un processo di equilibrio, il dialisiato può essere aggiornato più volte per spostare ulteriormente piccole molecole. Una volta completato il processo, il campione viene nuovamente raccolto per un'ulteriore elaborazione.
Ora che hai visto le basi della dialisi, diamo un'occhiata a una procedura generale.
Prima di iniziare la procedura, la membrana viene presata in dialisi. Questo lo rende più facile da usare e rimuove eventuali conservanti. Una volta pronto, il campione viene raccolto, in genere con una siringa e quindi aggiunto al contenitore per dialisi. Questo può essere un tubo nudo o contenuto all'interno di una cassetta. L'aria in eccesso viene rimossa dalla configurazione di dialisi per massimizzare la superficie del campione con la membrana. L'impostazione viene quindi posizionata nel dialisi con agitazione per massimizzare la diffusione. Dovrebbe galleggiare per non inibire l'agitazione.
Il dialisi viene modificato a intervalli rilevanti al raggiungimento dell'equilibrio tra campione e dialisi. Dopo l'ultimo cambiamento, la reazione viene in genere lasciata correre durante la notte. Dopo un periodo di tempo sufficiente, il campione privo di buffer o scambiato viene rimosso dalla cassetta. Una volta raccolto, il campione può essere analizzato o ulteriormente elaborato, a seconda della natura dell'esperimento.
Ora che abbiamo esaminato una procedura di dialisi generale, vediamo alcuni dei modi in cui questa tecnica viene utilizzata in biochimica.
I gradienti di densità sono un modo comune per separare campioni biologici complessi. Questo concetto si basa sulla distribuzione su piccole particelle, tipicamente ioni saccarosio o cloruro di cesio. Una volta completati, questi reagenti in genere devono essere rimossi prima che il campione raccolto possa essere elaborato. La dialisi consente di utilizzare il campione purificato per analisi future.
Alcune proteine si trovano all'interno del doppio strato lipidico di una cellula e di solito sono studiate intervallandole in vescicole lipidiche sferiche note come liposomi. Le proteine e i lipidi vengono prima estratti con un detergente. La dialisi può essere utilizzata per rimuovere lentamente il detergente, formando proteolipolismi.
Dopo la purificazione, alcune proteine vengono mal ripiegate o denaturate, portando a una perdita di funzionalità. I composti che causano questi cambiamenti nella struttura possono essere rimossi con la dialisi, portando alla riforma degli analiti funzionanti.
Hai appena visto il video di JoVE sulla dialisi. Ora dovresti capire questo metodo basato sulla diffusione, una semplice procedura sperimentale e l'uso di questa tecnica.
Grazie per l'attenzione!
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
