Biochemistry
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Estrazione di caffeina, l'attività enzimatica e l'espressione genica della sintasi di caffeina da sospensioni di cellule vegetali
Chapters
Summary October 2nd, 2018
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Questo protocollo descrive una metodologia efficace per l'estrazione e la quantificazione di caffeina in sospensioni cellulari di L. c. arabica e un processo sperimentale per valutare l'attività enzimatica della sintasi di caffeina con il livello di espressione il gene che codifica per questo enzima.
Transcript
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei settori della chimica analitica, della biochimica e della biotecnologia. Ad esempio, quali sono i cambiamenti che si verificano nella biosintesi della caffeina. Il principale vantaggio di questa tecnica, è che può essere applicato a modelli di piante di invitro che producono caffeina.
Per iniziare, aggiungere 10 millilitri di acetone alle cellule lyophilized e sigillare il pallone prima di mescolare con il miscelatore a vortice per 30 secondi. Quindi, mescolare il campione a 100 giri/min con un rotatore per cinque ore a temperatura ambiente. Successivamente, sospendere di nuovo il campione con 25 microlitri di acetone.
In primo luogo, applicare un microlitro dell'estratto di caffeina precedentemente preparato sulle piastre di gel di silice. Quindi, sviluppare il TLC nella camera cromatografica con 10 millilitri della fase mobile, cicloesano acetone. Visualizza le bande di caffeina in ultravioletto a lunghezza d'onda corta, con una lampada UV compatta.
Successivamente, quantificare i livelli di caffeina per densitometria a 273 nanometri. Utilizzando carta da filtro, filtrare sottovuoto le sospensioni cellulari precedentemente preparate. Quindi, utilizzare una malta di porcellana per macerare il campione di cellule, con azoto liquido e reagente di isolamento dell'RNA, fino a quando non viene omogeneizzato.
Successivamente, trasferire 500 microlitri del campione in un tubo sterile di micro centrifuga. Quindi, aggiungere 300 microlitri di alcol isoamlico cloroformio e 300 microlitri di fenolo equilibrato. Mescolare il campione con un miscelatore a vortice e centrifugarlo a 20.000G per 15 minuti a quattro gradi Celsius.
Successivamente, trasferire 300 microlitri della fase superiore in un tubo di micro centrifuga pulito. Quindi, aggiungere 200 microlitri di isopropanolo e incubare il tubo per un'ora a -20 gradi Celsius. Aggiungere un millilitro di etanolo al pellet.
Quindi, centrifugare il tubo a 12.000G per 10 minuti e decantare la fase liquida. Quindi, asciugare il campione per 1,5 ore a temperatura ambiente. Quindi, sospendere di nuovo l'estratto di RNA con 25 microlitri di acqua trattata con DEPC.
In primo luogo, aggiungere due microgrammi di estratto totale di RNA a un tubo sterile di micro centrifuga. Quindi, aggiungere un microlitro di tampone di reazione 10X e un microlitro di DNasi. Portare il volume finale della reazione a 10 microlitri con acqua trattata con DEPC.
Quindi, mescolare il campione e la centrifuga a 2.000G per un minuto. Successivamente, incubare il campione a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, aggiungere un microlitro di 50 tetraacetato di disodico di etilene disodico micromolare, per interrompere la reazione.
Incubare il campione a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, applicare 100 nanogrammi di RNA su un gel di agarosio ed eseguire il gel. Visualizza l'integrità dell'RNA utilizzando un sistema di documentazione fotografica in gel.
In primo luogo, aggiungere 2,5 microgrammi di RNA totale a un tubo di micro centrifuga. Quindi, aggiungere un microlitro di primer oligo deossitimidina e riempire il tubo a un volume finale di 13 microlitri con acqua priva di nucleasi. Mescolare il campione e centrifugarlo a 2.000G per un minuto.
Incubare il campione a 65 gradi Celsius per cinque minuti. E poi a quattro gradi Celsius per due minuti. Successivamente, aggiungere quattro microlitri di tampone di reazione 5X, due microlitri di miscela dNTP e un microlitro di transcriptasi inversa al campione.
Quindi, mescolare delicatamente il campione e centrifugare a 2.000G per un minuto. Dopo questo, incubare il campione a 45 gradi Celsius per 50 minuti, quindi a 70 gradi Celsius per 10 minuti. Aggiungere 7,5 microlitri di 2X Taq DNA polimerasi e 0,1 micromoli di RAX, a un tubo di micro centrifuga PCR.
Quindi, aggiungere 0,75 microlitri ciascuno di primer avanti e indietro per amplificare il gene CCS1. Successivamente, aggiungere 600 nanogrammi di modello CDNA. Preformare la reazione di amplificazione in tempo reale PCR come descritto nel protocollo di testo.
Quindi, analizzare i dati con il software PCR. Pesare un grammo di materiale cellulare e imballarlo in un foglio di alluminio. Dopo aver macerato il campione, trasferirlo su una fiala di vetro e aggiungere 2,5 millilitri di tampone di estrazione.
Quindi, centrifuga il campione a 20.000G per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire 500 aliquote microlitri in flaconcini criogenici. Con uno spettrofotometro, misurare la concentrazione proteica del campione a 562 nanometri utilizzando un saggio di acido bicinchoninico, con l'albumina serica bovina come standard.
In primo luogo, preparare la miscela di reazione in un tubo di micro centrifuga, secondo il protocollo di testo. Quindi, aumentare il volume totale a 200 microlitri con tris HCL da 100 millimolare. Ricorda, è imperativo per la tua sicurezza seguire le dovute precauzioni durante la preparazione della miscela di reazione con materiale radioattivo.
Mantenere il tubo di micro centrifuga sul ghiaccio e aggiungere un volume della frazione solubile, contenente da sette a nove milligrammi di proteine. Quindi, vortice la miscela e incubare a 30 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, centrifugare i campioni a 11.000G per cinque minuti.
Quindi, recuperare attentamente un volume di 900 microlitri e trasferire i campioni in una fiala a scintillazione. Successivamente, evaporare il cloroformio per completare la secchezza nel cappuccio a temperatura ambiente. Aggiungere cinque millilitri di liquido di scintillazione al flaconcino.
Infine, analizzare la radioattività incorporata nella caffeina utilizzando un contatore di scintillazione. In questo protocollo, il modello di assorbanza per la caffeina è stato analizzato tramite densitometria TLC, attraverso lo spettro della luce visibile, e leggendo in massimo assorbimento a 273 nanometri. La curva di separazione della caffeina sulla piastra TLC, ha mostrato una RF compresa tra 0,34 e 0,39.
L'RNA derivato da cellule sospese mostra chiare separazioni delle subunità di RRNA 28s, 18s e 5s, indicando che i campioni erano di alta qualità. Infine, una curva di fusione è stata ottenuta dall'analisi QPCR, mostrando un singolo prodotto di amplificazione per il gene della caffeina sintasi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nei campi della biotecnologia e della biochimica per esplorare la coltura secondaria dei tessuti metabolizzante da caffè, tè e cocco.
Non dimenticare che lavorare con la radioattività e la patologia molecolare può essere estremamente pericoloso e precauzioni come l'uso di guanti, occhiali e attrezzature speciali per materiale radioattivo devono sempre essere prese quando si esegue questa procedura.
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