Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Одновременного измерения внутриклеточного кальция и мембранный потенциал в свеже изолированных и нетронутыми мыши мозгового эндотелия
Chapters
Summary January 20th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Протоколы изоляции (1) свеже нетронутыми церебральный эндотелиальных «трубы» и (2) одновременных измерений эндотелиальной кальция и мембранного потенциала во время эндотелий производные гиперполяризации продемонстрировали здесь. Кроме того эти методы позволяют для фармакологической тюнинг эндотелиальных клеток кальция и электрической сигнализации как индивидуальных или интерактивные экспериментальные переменные.
Transcript
Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области церебральной сосудистой физиологии, поскольку он относится к регуляции мозгового кровотока во время старения и развития хронических заболеваний. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет одновременно измерять внутриклеточный кальций и мембранный потенциал мозгового артериального эндотелия в его родной форме в физиологических условиях. Чтобы изолировать мозг мыши, под микроскопом удалить кожу и волосы над черепом.
И удалить чрезмерную кровь с холодным без кальция PSS. Далее сделайте разрез, используя только кончики стандартных ножниц для вскрытия. Начиная с затылочной кости и простираясь через носовую кость черепа.
Затем открыть ее череп тщательно вдоль разреза, используя грубо наконечником типсы и отделить соединительной ткани подвергать мозга. Аккуратно мыть изолированный мозг с холодным без кальция PSS в стакан, чтобы удалить кровь. Поместите вентралую сторону мозга в камеру, содержащую холодный раствор вскрытия для изоляции мозговых артерий.
Чтобы изолировать мозговые артерии, закрепить изолированный мозг в холодном растворе вскрытия, вставив через него две булавки из нержавеющей стали, в кремниевое полимерное покрытие, пропитанное углем, на дне стеклянной чашки Петри. Впоследствии хирургически изолируют задние мозговые артерии от 0,3 до 0,5 сантиметра сегментов от задней связи и базилярных артерий. Используйте булавки из нержавеющей стали для обеспечения обеих изолированных задних мозговых артерий в растворе вскрытия в чашке Петри.
Затем тщательно очистите изолированные задние мозговые артерии, удалив соединительной ткани с помощью заточенных тонко наклонных типсов. Разрежьте нетронутые артерии на один-два миллиметра для энзиматического пищеварения. В этой процедуре подготовьтесь к тритурации аппарата с помощью микроскопа, камеры и алюминиевой сцены с камерой и микроманипуляторами.
Закрепив микрохирург с помощью насосного контроллера, примыкающего к сцене и образцу. Далее полностью заполнешь титрование пипеткой с минеральным маслом и закрепим ее над микросхемой поршня. Затем с помощью микросиренго с контроллером насоса свяжись около 130 нанолитров раствора диссоциации в пипетку, обеспечивая при этом отсутствие пузырьков воздуха.
Впоследствии поместите нетронутые артериальные сегменты в один миллилитр раствора диссоциации с необходимой концентрацией ферментов в 10 миллилитров стеклянной трубке. Инкубировать при 34 градусах по Цельсию в течение 10-12 минут для частичного пищеварения. После пищеварения замените ферментный раствор пятью миллилитров свежего раствора диссоциации.
Используя одноми миллилитровую пипетку, перенесите один сегмент в камеру, содержащую раствор диссоциации при комнатной температуре. Затем поместите пипетку в раствор диссоциации в камере и поместите ее близко к одному концу переваренного сосуда. Установите скорость в диапазоне от двух до пяти нанолитров в секунду на контроллер насоса для мягкой тритурации.
При просмотре через 100 раз до 200 раз увеличение снять и извлечь артериальный сегмент, чтобы разобщить гладкие мышечные клетки при производстве эндотелиальной трубки. При необходимости осторожно используйте мелконаводные типсы, чтобы отделить диссоциированную адвентитию и внутреннюю эластичную ламину от эндотелиальной трубки. Подтвердите, что все гладкие мышечные клетки разобщены и что только эндотелиальные клетки остаются нетронутыми трубки.
Используя микроманипуляторы, закрепите каждый конец эндотелиальной трубки на стеклянной крышке скольжения суперфузионой камеры с помощью борозиликатного стекла, закрепления пипеток. Вымойте диссоциированных adventitia и гладкие мышечные клетки из камеры. И заменить раствор диссоциации на два моляра больше хлорида кальция PSS.
Перенесите мобильную платформу с закрепленной эндотелиальной трубкой на микроскоп суперфузии и экспериментальной установки. Затем используйте шесть чистых 50 миллилитров резервуаров для непрерывной доставки PSS и соответствующих лекарственных растворов в ходе эксперимента. Используйте в линии клапан управления потоком вручную установить скорость потока, как последовательный, как поток ламинера при сопоставлении потока корма для вакуумного всасывания.
Доставка PSS в камеру для суперфузии эндотелиальной трубки, по крайней мере пять минут до записи фоновых данных и загрузки красителя. Чтобы измерить мембранный потенциал одновременно с внутриклеточной концентрацией кальция, потяните острый электрод и заполньте его двумя хлоридом молярного калия для записи из клеток, загруженных красителем фура-2. Для изучения внутриклеточной связи с помощью передачи красителя, backfill микроэлектрода с 0,1%propidium йодид растворяется в двух молир хлорида калия.
Далее поместите электрод над серебряной проволокой, покрытой хлоридом, в держатель пипетки, прикрепленный к электрометровой головной ступени, закрепленной микроманипулятором. Используйте микроманипулятор, чтобы кратко располагать кончик электрода в протекающей PSS в камере, при просмотре через четыре раза цели. Впоследствии установите потенциал мембраны отдыха до нуля в соответствии с заземленным потенциалом ванны.
При желании используйте звуковые базовые мониторы, связанные с электрометрами, чтобы связать звуковой шаг с потенциальными записями. После этого увеличьте увеличение до 400 раз, используя цель в 40 раз, и располагайте кончик электрода чуть выше клетки эндотелиальной трубки. Отрегулируйте фотометрическое окно с помощью программного обеспечения для фотометрии, чтобы сосредоточиться на 50-80 эндотелиальных ячейках.
Затем аккуратно поместите электрод в одну из клеток эндотелиальной трубки с помощью микроманипулятора и подождите не менее двух минут, пока потенциал мембраны отдыха стабилизируется. После того, как потенциал мембраны отдыха стабилен при ожидаемом значении, включите фотомультипьерную трубку на флуоресцентном интерфейсе при отсутствии света и начните приобретение внутриклеточной концентрации кальция захватывающим Fura-2 поочередно на 340 и 380 нанометров при сборе выбросов флуоресценции на 510 нанометров. После одновременного измерения мембранного потенциала и внутриклеточной концентрации кальция, позволяют около пяти минут для суперфузии эндотелиальной трубки с PSS при постоянной скорости ламинарного потока до применения препаратов.
Нанесите препарат, приготовленный в PSS, в камеру суперфузии с постоянной скоростью потока. Во время лечения препарата измеряется мембранный потенциал в соотношении F340/F380 одновременно. После того, как эксперимент будет сделан, вывести электрод из клетки.
Затем прекратите соответствующие записи мембранного потенциала и внутриклеточной концентрации кальция и сохраните файлы для анализа данных. Это дифференциальное интерференционное контрастное изображение мыши мозговой артериальной эндотелиальной трубки, скорректированное для эксперимента в фотометрическом окне с использованием 40-разовой цели. Острый электрод помещается в ячейку, как показано в верхней части изображения.
Вот примеры необработанных следов для одновременного измерения соотношения F340/F380 и мембранного потенциала в ответ на 100 микромолянных АТФ. После этой процедуры, другие методы, такие как конфокальная флуоресцентная микроскопия, могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, касающиеся микродомена сигнализации эндотелиального кальция, и реактивных видов кислорода, в качестве примеров. В целом этот метод будет продолжать прокладывать путь для исследований в клеточной физиологии для изучения сосудистой функции и старения в крови и лимфатической циркуляции.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
