사진 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP) Amyloidogenic 펩티드에 적용

1. 펩타이드 준비

1. 라벨, 실리콘 코팅, 낮은 흡착제 microfuge 튜브에 microbalance 및 전송을 사용하여 동결 건조된 펩타이드의 ~ 100-200 μg를 달다. 여기, 우리는 Aβ40의 인간 시퀀스, Aβ42, 칼시토닌, 그리고 GRF를 사용합니다.
2. 여기, 우리는 단일 펩티드, 집계없는 준비를 얻기 위해 1,1,1,3,3,3 - hexafluoro - 2 - 프로파놀 (HFIP)로 사전 처리를 사용합니다. 사전 구성된 집계가 실험 ⁵ 중에서 가난한 재현성의 결과 amyloidogenic 단백질의 신속한 집계를 유발하기 때문에이 단계가 필요합니다. 이러한 여과 및 SEC와 같은 다른 방법도 PICUP ⁶ 총체적없는 준비를 얻는 데 사용할 수 있습니다.
3. HFIP와 펩티드를 치료하기 위해 적절한 보호 (HFIP는 휘발성과 독성)을 입고 연기 후드 안에 얼음 HFIP 컨테이너를 미리 진정해. 250 ML 병의 냉각하면 일반적으로 10-15 분 필요합니다. 0.5 mm의 공칭 펩타이드 농도를 구하는 펩티드 lyophilizates를 포함하는 미리 차게 튜브에 HFIP를 추가합니다.
4. 상온에서 5 분 물 목욕 sonicator의 펩타이드 솔루션을 Sonicate.
5. 부드럽게 소용돌이와 실온에서 30 분 튜브를 품어.
6. 얼음 (1 분)에 튜브를 칠하고, 레이블 0.6 - ML 낮은 흡착제 튜브에서 10-50 - μl aliquots에 솔루션을 나눕니다.
7. 질소의 부드러운 흐름에 따라 증발에 의해 HFIP를 제거하거나, 하룻밤 퓸 후드에서 열 튜브를 두십시오. 하룻밤 증발 들어, 랙에 오픈 튜브를 삽입하고 먼지와 미립자 오염을 방지하기 위해 Kimwipes의 큰 시트를 커버.
8. lyophilizer에 vacuo에 남아있는 HFIP, 30 분 원심 농축기를 바싹 말리다, 또는 2 H.위한 진공 입구에 부착된 exsiccator에 최종 제품은 microfuge 튜브의 하단에있는 펩타이드 영화 것입니다. 제대로 exsiccated 경우, 튜브가 -20 또는 -80 ° C.에 연장 기간 (개월)에 대한 완벽한 저장할 수 있습니다

2. HFIP - 대우 펩티드를 Solubilizing과 사진이 교차 연결

1. 가교 반응, 교차 연결 및 담금질의 시약을 준비 한 요구에 HFIP - 대우 펩티드를 solubilizing 전에.
2. 암모늄 persulfate를 달다 (APS, 미스터 228.2 g / 몰)와 10 MM의 인산 나트륨, 산도 7.4에서 20 MM 솔루션을 준비합니다. 솔루션 분명히 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다.
3. 10 MM의 인산 나트륨, 산도 7.4의 트리스 1 MM 솔루션 (2,2 - bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate을 (RuBpy 씨, 748.63 g / 몰) 준비합니다. 소용돌이를 사용하여 혼합하고 완전한 해체를 확인합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛을에서 튜브를 보호합니다.
4. 가교 다음과 SDS - PAGE 분석을 위해, 편리한 담금질 시약은 2 5% β - 메르 캅 토 에탄올이다 × SDS - PAGE 샘플 버퍼. 또는, 1 M dithiothreitol (DTT, 씨 154.5 g / 몰) 탈이온수 또는 적절한 버퍼에 사용할 수 있습니다.
5. HFIP - 치료 펩타이드 필름은 희석 NaOH 먼저 해산하고 다음 인산 나트륨 버퍼는 ~ 30 μm의 펩타이드의 농도를 얻을에 추가됩니다. 추가 60 MM NaOH는 NaOH와 물을 각각 10 최종 볼륨의 45 %, 구성 이러한 펩타이드 필름이 들어있는 튜브에 탈이온수 다음. 팁 최대 pipetting 아래로 혼합하고, 물 목욕 sonicator 5 분 sonicate를 사용 microfuge 튜브의 내벽에서 펩타이드 필름을 다쳤어요.
6. 45% 20 MM의 인산 나트륨, 산도 7.4, pipetting으로 혼합, 10 분 1만6천g에서 원심 분리기를 추가합니다. 부정적인 컨트롤을위한 담금질 시약과 혼합 uncross 연계 펩티드의 aliquots을 따로 설정합니다.
7. 1 s의 카메라 셔터 지연을 조정 높은 조사 시간에 광범위한 급진적인 반응 단백질 저하의 원인이 될 수 있습니다. 카메라 셔터를로드합니다. 조사 시간은 새로운 단백질과 방법을 사용할 때 최적화할 필요가 있습니다.
8. 전형적인 PICUP 반응은 20 μl 반응 볼륨에서 수행됩니다. , 얇은 벽으로 둘러싸인, 맑은 0.2 - ML PCR 튜브에 펩타이드 솔루션을 18 μl을 전송합니다.
9. 펩타이드 솔루션, 1 μl APS 다음 1 μl RuBpy를 추가하고 (반응 혼합물에 RuBpy와 APS의 최종 농도가 0.05 및 1 ㎜ 각각됩니다) pipetting하여 시약을 섞는다.
10. 신속하게 반응 관 1.8 ML의 유리관 안에 넣습니다. 카메라 본체의 전면에 붙어있는 벨로우즈 내부의 병을를 놓습니다. 렌즈 보호를 첨부와 샘플이 벨로우즈 내부 1 S에 대한 조사가되도록 셔터를 누르십시오.
11. 샘플 조사 후, 신속하게 유리병 밖으로 풀무와 PCR 튜브의 병을 꺼내. 신속 한 μl DTT, 10 μl 절감 페이지 샘플 버퍼를 추가하여 반응은 끄지. 각 펩타이드 나누어지는에 대한 반응을 반복합니다.
12. 반응 혼합물은 이제 노 칠일 이상 또는 SDS - PAGE와 실버 얼룩으로 분석하기 전에 얼음에 보관을위한 스토리지 -20 ° C에 냉동 수 있습니다.

3. SDS - PAGE와 은색 - 염색법교차 연결된 펩타이드 제품

1. 정기적인 SDS - PAGE와 실버 얼룩이 교차 연결된 펩티드를 시각화하기 위해 수행됩니다.
2. 차선 당 펩티드의 ~ 130 pmol를 얻을 레인 당 반응 혼합물의 5 μl를로드합니다.
3. 비교 uncross 연계 펩티드 비슷한 금액을 포함합니다. 펩타이드 밴드의 분자량의 시각 근사치에 대한 표준 단백질 사다리도 포함됩니다.
4. 표준 겔 전기 영동 장치를 사용하여 겔을 실행합니다. 우리는 Invitrogen에서 XCell SureLock 미니 셀 시스템을 사용하고 Invitrogen 출판 IM - 1002, Novex 사전 캐스트 젤 전기 영동 안내에 따라 실버 얼룩을 수행합니다.

4 부 : 대표 결과 (그림 1)

그림 1 : uncross 링크된 보여주는 실버 - 스테인드 polyacrylamide의 젤 - (+) GRF, 칼시토닌, Aβ40과 Aβ42과 사진 - 상호 연결된 ()를

SDS - PAGE와 PICUP 생성 Aβ40 oligomers의 실버 얼룩 분석은 높은 oligomers ⁷ 풍부하게 날카로운 감소 다음 tetramer를 통해 모노머 약 유사한 밴드 농도를 보여줍니다. Uncross 링크된 Aβ40는 모노머 ⁷ 그것과 일치 미스터와 함께 마이 그 레이션합니다. Aβ42는 뚜렷한 올리고머 크기 분포를 보여줍니다. Aβ42 oligomers 2-3 그룹 ⁸ 구성됩니다. 첫 번째 그룹, trimer를 통해 모노머가 증가 올리고머 주문과 함께 강도를 감소 표시됩니다. 두 번째 그룹에서, 가우스 같은 배포 pentamer과 hexamer에서 최대, tetramer 그리고 heptamer 사이에 관찰됩니다. 여기에 표시되지 않습니다 세 번째 그룹은, 씨 ~ 30,000-60,000 다 ⁸ oligomers가 포함되어 있습니다. 이러한 높은 미스터 oligomers는 일반적으로 SEC 절연 LMW Aβ42를 사용하여 관찰 있지만 펩티드는 여과 또는 HFIP 치료 ⁶ 준비가되어 있습니다. Uncross 링크된 Aβ42은 주로 두 그룹, 모노머의 밴드와 SDS ^5,9에 의해 유도된 인위입니다 광범위한 trimer / tetramer 밴드를 생산하고 있습니다. 칼시토닌 강력 dimers, trimers, 그리고 tetramers ⁷ 미리 존재를 제안, tetramer를 통해 지역 모노머의 단조로운 지수 감소에서 diverges 올리고머 크기 분포를 산출. 제어 polypeptide, GRF은 이합체에서 oligomers의 명백한 상대적 금액이 증가 분자 질량과 함께 기하 급수적으로 감소되는 등 hexamer를 통해 범위 monotonic 올리고머 분포를 생산하고 있습니다. 다른 실험에서, 높은 oligomers 또한 시각 ⁷ 수 있습니다. 정확한 번호와 올리고머 밴드의 상대적 농도는 실제 단백질 농도, 젤에 로드된 단백질의 양, 그리고 실버 얼룩 프로토콜의 개발 단계에 사용되는 시간에 따라 실험을 사이에 다소 차이가있을 수 있습니다.

PICUP는 안정적인 단백질 단지 ² 공부 원래 개발되었습니다. 방법은 Aβ ^10, 프리온 질병 - 관련 PrP ^{SC 11,} 및 α - synuclein ^12를 포함한 metastable 아밀로이드 단백질 어셈블리의 양적 연구 나중에 적용되었다. PICUP 실험을 디자인할 때 고려되어야하는 가장 중요한 요소는 시약의 stoichiometry, 조사 시간 및 샘플 준비 절차입니다. 후자 문제가 크게 실험 데이터의 해석에 영향을 미치는 반면 전직 두 가지 문제는 경험적 최적화가 필요할 수 있습니다. 특히 amyloidogenic 단백질 들어, metastable oligomers의 크기 배포판의 결정은 집계가없는 시작 준비를 사용합니다. 배경, 메커니즘, 계측, 프로토콜, 최적화, 범위, 수정, 응용 프로그램 및 PICUP의 제한은 이전 출판물 ^1,2,13로 덮여 있었다. PICUP는 다음과 같은 분류와 정화가, 구조 연구, 세포 독성의 assays, oligomerization - 저해 연구와 분자 인식 도구 개발을위한 목표로 사용할 수있는 안정적이고 가용성 단백질 oligomers을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.