Summary
사진 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP)의 것은 metastable 단백질 혼합물의 올리고머 크기 분포의 특성을 허용합니다. 우리는 세 대표 amyloidogenic 펩티드 40 PICUP의 응용 프로그램을 보여줍니다 - 그리고 아밀로이드 β 단백질 및 칼시토닌의 42 잔여물 형태 및 제어 펩타이드 성장 호르몬 방출 인자.
Abstract
독성 oligomers로 amyloidogenic 단백질의 조립은 알츠하이머, 파킨슨병과 헌팅턴의 질병, 유전 루게릭병, 그리고 2 형 당뇨병을 포함한 단백질 misfolding 질환의 pathogenesis에 있게한 이벤트입니다. 이러한 단백질 어셈블리의 metastable 특성 때문에, 그것은 전기, 크로마 토그래피, 형광, 또는 동적 광 산란과 같은 고전적인 방법을 사용하여 양적 자신의 올리고머의 크기 분포를 평가하기 어렵습니다. amyloidogenic 단백질 Oligomers은 oligomers가 단량체로 교제를 끊다 동시에 큰 어셈블리에 연결할하는 metastable 혼합물로 존재합니다. PICUP 교차하기 전에 존재 올리고머 크기 배포판 공유 결합 가교와 같은 나트륨 dodecyl 황산염의 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS - PAGE) 또는 크기 배제 크로마 토그래피 (SEC)와 같은 분류 방법과 결합하면 PICUP이 제공하는 스냅샷의 올리고머의 인구 안정화 - 연결. 따라서, PICUP는 metastable 단백질 인구의 시각화 및 정량 분석을 가능하게하고 시퀀스 수정 및 oligomerization 사이의 조립 및 해독 관계를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다
Protocol
1. 펩타이드 준비
- 라벨, 실리콘 코팅, 낮은 흡착제 microfuge 튜브에 microbalance 및 전송을 사용하여 동결 건조된 펩타이드의 ~ 100-200 μg를 달다. 여기, 우리는 Aβ40의 인간 시퀀스, Aβ42, 칼시토닌, 그리고 GRF를 사용합니다.
- 여기, 우리는 단일 펩티드, 집계없는 준비를 얻기 위해 1,1,1,3,3,3 - hexafluoro - 2 - 프로파놀 (HFIP)로 사전 처리를 사용합니다. 사전 구성된 집계가 실험 5 중에서 가난한 재현성의 결과 amyloidogenic 단백질의 신속한 집계를 유발하기 때문에이 단계가 필요합니다. 이러한 여과 및 SEC와 같은 다른 방법도 PICUP 6 총체적없는 준비를 얻는 데 사용할 수 있습니다.
- HFIP와 펩티드를 치료하기 위해 적절한 보호 (HFIP는 휘발성과 독성)을 입고 연기 후드 안에 얼음 HFIP 컨테이너를 미리 진정해. 250 ML 병의 냉각하면 일반적으로 10-15 분 필요합니다. 0.5 mm의 공칭 펩타이드 농도를 구하는 펩티드 lyophilizates를 포함하는 미리 차게 튜브에 HFIP를 추가합니다.
- 상온에서 5 분 물 목욕 sonicator의 펩타이드 솔루션을 Sonicate.
- 부드럽게 소용돌이와 실온에서 30 분 튜브를 품어.
- 얼음 (1 분)에 튜브를 칠하고, 레이블 0.6 - ML 낮은 흡착제 튜브에서 10-50 - μl aliquots에 솔루션을 나눕니다.
- 질소의 부드러운 흐름에 따라 증발에 의해 HFIP를 제거하거나, 하룻밤 퓸 후드에서 열 튜브를 두십시오. 하룻밤 증발 들어, 랙에 오픈 튜브를 삽입하고 먼지와 미립자 오염을 방지하기 위해 Kimwipes의 큰 시트를 커버.
- lyophilizer에 vacuo에 남아있는 HFIP, 30 분 원심 농축기를 바싹 말리다, 또는 2 H.위한 진공 입구에 부착된 exsiccator에 최종 제품은 microfuge 튜브의 하단에있는 펩타이드 영화 것입니다. 제대로 exsiccated 경우, 튜브가 -20 또는 -80 ° C.에 연장 기간 (개월)에 대한 완벽한 저장할 수 있습니다
2. HFIP - 대우 펩티드를 Solubilizing과 사진이 교차 연결
- 가교 반응, 교차 연결 및 담금질의 시약을 준비 한 요구에 HFIP - 대우 펩티드를 solubilizing 전에.
- 암모늄 persulfate를 달다 (APS, 미스터 228.2 g / 몰)와 10 MM의 인산 나트륨, 산도 7.4에서 20 MM 솔루션을 준비합니다. 솔루션 분명히 때까지 소용돌이를 사용하여 섞는다.
- 10 MM의 인산 나트륨, 산도 7.4의 트리스 1 MM 솔루션 (2,2 - bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrate을 (RuBpy 씨, 748.63 g / 몰) 준비합니다. 소용돌이를 사용하여 혼합하고 완전한 해체를 확인합니다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛을에서 튜브를 보호합니다.
- 가교 다음과 SDS - PAGE 분석을 위해, 편리한 담금질 시약은 2 5% β - 메르 캅 토 에탄올이다 × SDS - PAGE 샘플 버퍼. 또는, 1 M dithiothreitol (DTT, 씨 154.5 g / 몰) 탈이온수 또는 적절한 버퍼에 사용할 수 있습니다.
- HFIP - 치료 펩타이드 필름은 희석 NaOH 먼저 해산하고 다음 인산 나트륨 버퍼는 ~ 30 μm의 펩타이드의 농도를 얻을에 추가됩니다. 추가 60 MM NaOH는 NaOH와 물을 각각 10 최종 볼륨의 45 %, 구성 이러한 펩타이드 필름이 들어있는 튜브에 탈이온수 다음. 팁 최대 pipetting 아래로 혼합하고, 물 목욕 sonicator 5 분 sonicate를 사용 microfuge 튜브의 내벽에서 펩타이드 필름을 다쳤어요.
- 45% 20 MM의 인산 나트륨, 산도 7.4, pipetting으로 혼합, 10 분 1만6천g에서 원심 분리기를 추가합니다. 부정적인 컨트롤을위한 담금질 시약과 혼합 uncross 연계 펩티드의 aliquots을 따로 설정합니다.
- 1 s의 카메라 셔터 지연을 조정 높은 조사 시간에 광범위한 급진적인 반응 단백질 저하의 원인이 될 수 있습니다. 카메라 셔터를로드합니다. 조사 시간은 새로운 단백질과 방법을 사용할 때 최적화할 필요가 있습니다.
- 전형적인 PICUP 반응은 20 μl 반응 볼륨에서 수행됩니다. , 얇은 벽으로 둘러싸인, 맑은 0.2 - ML PCR 튜브에 펩타이드 솔루션을 18 μl을 전송합니다.
- 펩타이드 솔루션, 1 μl APS 다음 1 μl RuBpy를 추가하고 (반응 혼합물에 RuBpy와 APS의 최종 농도가 0.05 및 1 ㎜ 각각됩니다) pipetting하여 시약을 섞는다.
- 신속하게 반응 관 1.8 ML의 유리관 안에 넣습니다. 카메라 본체의 전면에 붙어있는 벨로우즈 내부의 병을를 놓습니다. 렌즈 보호를 첨부와 샘플이 벨로우즈 내부 1 S에 대한 조사가되도록 셔터를 누르십시오.
- 샘플 조사 후, 신속하게 유리병 밖으로 풀무와 PCR 튜브의 병을 꺼내. 신속 한 μl DTT, 10 μl 절감 페이지 샘플 버퍼를 추가하여 반응은 끄지. 각 펩타이드 나누어지는에 대한 반응을 반복합니다.
- 반응 혼합물은 이제 노 칠일 이상 또는 SDS - PAGE와 실버 얼룩으로 분석하기 전에 얼음에 보관을위한 스토리지 -20 ° C에 냉동 수 있습니다.
3. SDS - PAGE와 은색 - 염색법교차 연결된 펩타이드 제품
- 정기적인 SDS - PAGE와 실버 얼룩이 교차 연결된 펩티드를 시각화하기 위해 수행됩니다.
- 차선 당 펩티드의 ~ 130 pmol를 얻을 레인 당 반응 혼합물의 5 μl를로드합니다.
- 비교 uncross 연계 펩티드 비슷한 금액을 포함합니다. 펩타이드 밴드의 분자량의 시각 근사치에 대한 표준 단백질 사다리도 포함됩니다.
- 표준 겔 전기 영동 장치를 사용하여 겔을 실행합니다. 우리는 Invitrogen에서 XCell SureLock 미니 셀 시스템을 사용하고 Invitrogen 출판 IM - 1002, Novex 사전 캐스트 젤 전기 영동 안내에 따라 실버 얼룩을 수행합니다.
4 부 : 대표 결과 (그림 1)
그림 1 : uncross 링크된 보여주는 실버 - 스테인드 polyacrylamide의 젤 - (+) GRF, 칼시토닌, Aβ40과 Aβ42과 사진 - 상호 연결된 ()를
SDS - PAGE와 PICUP 생성 Aβ40 oligomers의 실버 얼룩 분석은 높은 oligomers 7 풍부하게 날카로운 감소 다음 tetramer를 통해 모노머 약 유사한 밴드 농도를 보여줍니다. Uncross 링크된 Aβ40는 모노머 7 그것과 일치 미스터와 함께 마이 그 레이션합니다. Aβ42는 뚜렷한 올리고머 크기 분포를 보여줍니다. Aβ42 oligomers 2-3 그룹 8 구성됩니다. 첫 번째 그룹, trimer를 통해 모노머가 증가 올리고머 주문과 함께 강도를 감소 표시됩니다. 두 번째 그룹에서, 가우스 같은 배포 pentamer과 hexamer에서 최대, tetramer 그리고 heptamer 사이에 관찰됩니다. 여기에 표시되지 않습니다 세 번째 그룹은, 씨 ~ 30,000-60,000 다 8 oligomers가 포함되어 있습니다. 이러한 높은 미스터 oligomers는 일반적으로 SEC 절연 LMW Aβ42를 사용하여 관찰 있지만 펩티드는 여과 또는 HFIP 치료 6 준비가되어 있습니다. Uncross 링크된 Aβ42은 주로 두 그룹, 모노머의 밴드와 SDS 5,9에 의해 유도된 인위입니다 광범위한 trimer / tetramer 밴드를 생산하고 있습니다. 칼시토닌 강력 dimers, trimers, 그리고 tetramers 7 미리 존재를 제안, tetramer를 통해 지역 모노머의 단조로운 지수 감소에서 diverges 올리고머 크기 분포를 산출. 제어 polypeptide, GRF은 이합체에서 oligomers의 명백한 상대적 금액이 증가 분자 질량과 함께 기하 급수적으로 감소되는 등 hexamer를 통해 범위 monotonic 올리고머 분포를 생산하고 있습니다. 다른 실험에서, 높은 oligomers 또한 시각 7 수 있습니다. 정확한 번호와 올리고머 밴드의 상대적 농도는 실제 단백질 농도, 젤에 로드된 단백질의 양, 그리고 실버 얼룩 프로토콜의 개발 단계에 사용되는 시간에 따라 실험을 사이에 다소 차이가있을 수 있습니다.
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Discussion
PICUP는 안정적인 단백질 단지 2 공부 원래 개발되었습니다. 방법은 Aβ 10, 프리온 질병 - 관련 PrP SC 11, 및 α - synuclein 12를 포함한 metastable 아밀로이드 단백질 어셈블리의 양적 연구 나중에 적용되었다. PICUP 실험을 디자인할 때 고려되어야하는 가장 중요한 요소는 시약의 stoichiometry, 조사 시간 및 샘플 준비 절차입니다. 후자 문제가 크게 실험 데이터의 해석에 영향을 미치는 반면 전직 두 가지 문제는 경험적 최적화가 필요할 수 있습니다. 특히 amyloidogenic 단백질 들어, metastable oligomers의 크기 배포판의 결정은 집계가없는 시작 준비를 사용합니다. 배경, 메커니즘, 계측, 프로토콜, 최적화, 범위, 수정, 응용 프로그램 및 PICUP의 제한은 이전 출판물 1,2,13로 덮여 있었다. PICUP는 다음과 같은 분류와 정화가, 구조 연구, 세포 독성의 assays, oligomerization - 저해 연구와 분자 인식 도구 개발을위한 목표로 사용할 수있는 안정적이고 가용성 단백질 oligomers을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 공중 보건의 캘리포니아학과에서 래리 L. Hillblom 알츠하이머 협회 재단 IIRG - 07-58334, 07-65798에서와 NIH / NIA, 2005/2E에서 보조금 AG027818 및 AG030709 지원했다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dolan-Jenner 200-W incandescent lamp | Other | Dolan-Jenner Industries | Model 170-D | The heat generated by the lamp d–s not affect samples for short incubation periods. |
| 35-mm SLR camera body | Tool | Pentax | SP500 model | In our settings, a bellows is attached to the body of the camera to provide a convenient chamber for irradiation of the sample placed 10 cm away from the light source. |
| Clear, thin walled PCR tubes | Other | Eppendorf | 951010006 supplied by Fisher L22-003-24 | |
| Glass vials (1.8 mL) | Other | Kimble Chase | 60940A 2, supplied by Fisher 03-340-60 | |
| GRF | Reagent | Bachem | H-3695 | |
| HFIP | Reagent | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. |
| Aβ40 and Aβ42 | Reagent | UCLA Biopolymers Laboratory | ||
| Calcitonin | Reagent | American Peptide | 22-1-10 | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| Ammonium persulfate | Reagent | Sigma-Aldrich | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Sigma-Aldrich | M7154-25 ML | Can be used when SDS-PAGE analysis is performed. |
| Novex Tricine SDS Sample Buffer (2x) | Reagent | Invitrogen | LC1676 | |
| XCell SureLock Mini-Cell | Tool | Invitrogen | EI0001 | |
| Novex Tricine Gels (10-20%) | Other | Invitrogen | EC6625B0X | |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10x ) | Invitrogen | LC1675 | ||
| Silver Express Staining Kit | Invitrogen | LC6100 |
References
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