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 JoVE Biology

Detección rápida homogénea de Ensayos Biológicos Usando el Sistema de modulación magnética biosensores

1,2, 3, 4, 1

1Department of Physical Electronics, Faculty of Engineering, Tel Aviv University, 2Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis, 3Department of Biological Sciences, University of Illinois, 4Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University

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    Summary

    Magnética modulación del sistema de biosensores se utiliza a la rápida, sensible y simplemente detectar ensayos biológicos, como las moléculas de ADN y las proteínas.

    Date Published: 6/13/2010, Issue 40; doi: 10.3791/1935

    Cite this Article

    Danielli, A., Porat, N., Ehrlich, M., Arie, A. Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System. J. Vis. Exp. (40), e1935, doi:10.3791/1935 (2010).

    Abstract

    Una modulación magnética sistema de biosensores (MMB) [1,2] con rapidez y de manera homogénea detectado dianas biológicas a bajas concentraciones, sin ningún tipo de lavado o etapa de separación. Cuando la IL-8 fue objetivo, un «sandwich' ensayo basado adjunta bolas magnéticas con IL-8 anticuerpo de captura a la estreptavidina acoplados a la proteína fluorescente a través de la IL-8 blanco y un IL-8 con biotina de anticuerpos. El perlas magnéticas se maniobran en el movimiento oscilatorio de la aplicación de un gradiente de campo magnético a través alternando dos polos electromagnéticos. Las proteínas fluorescentes, que se adjuntan a las perlas magnéticas se condensan en el área de detección y sus movimientos dentro y fuera de un rayo láser ortogonales produce una señal periódica fluorescente que se demodulada con detección síncrona. El sistema de modulación biosensores magnéticos se utilizó anteriormente para detectar las secuencias de codificación de la proteína no estructural del virus Ibaraki 3 (NS3) del ADN complementario (ADNc) [2]. Las técnicas que se muestran en este trabajo para la manipulación externa y la condensación de las partículas se pueden utilizar para otras aplicaciones, por ejemplo, entrega de medicamentos magnéticamente acoplados

    Protocol

    IL-8 del ensayo:

    1. La mezcla de reacción fueron las siguientes cuatro componentes en 100 l de volumen final de tampón de ensayo en sus respectivas concentraciones. 10 l de bolas magnéticas con anticuerpos de captura en 100 bolas / l final de las concentraciones, 2 l de biotina IL-8 de anticuerpos en una concentración final nano-gram/μl, 1 l de proteínas fluorescentes de 20 estreptavidina concentración final nano-gram/μl, y 1 l de IL-8 blanco a 0,48 pico-gram/μl. Los componentes se añaden uno por uno para el tampón de ensayo y luego se agita durante 30 minutos.
    2. Una reacción de control se prepara de la misma manera sin la IL-8 blanco.
    3. Las reacciones son más tarde puesto sin ningún tipo de separación o etapa de lavado en las cubetas e inspeccionados con el sistema de MMB.

    MMB sistema:

    1. Coloque la cubeta en su posición entre los dos polos electromagnéticos.
    2. Operar la corriente de modulación y esperar 30 segundos para permitir la agregación y la condensación de las cuentas
    3. Medir la señal del amplificador lock-in con un osciloscopio.

    Los resultados representativos:

    La inspección visual de las cuentas agregadas presenta una clara diferencia entre la reacción con el objetivo y la reacción, sin el objetivo. En todas las reacciones con el objetivo, el exceso acumulado un agregado único y denso que se movía dentro y fuera del haz de láser de una manera unirse. Sin embargo, en toda la reacción sin que el objetivo, las cuentas fueron menos agregados y su movimiento se unen menos (ver Figura 1).

    Figura 1
    Figura 1: la inspección visual de inmunoensayo sándwich "(a) sin el objetivo de IL-8 (b) Con el objetivo de IL-8.

    El reloj de modulación polo (amarillo) y la señal de salida PMT (magenta), mientras que la detección de pico 0,48 gramos de IL-8 blanco se presenta en la Figura 1 (a). La modulación de frecuencia para cada polo está a 2 Hz. Sin embargo, como era de esperar teóricamente, cuando las perlas pasar el rayo láser, el PMT detecta la luz fluorescente y hay un pico en la tensión de salida PMT. Por lo tanto, la frecuencia de demodulación es de 4 Hz. Cuando la señal de la tensión premenstrual y el reloj se duplicó de modulación (4 Hz) se introducen en la cerradura en el amplificador, el detector de fases detecta la sincronización y los resultados con alto voltaje (ver Figura 2).

    Figura 2
    Figura 2: (a) el reloj de modulación (amarillo) y la señal de PMT (magenta) cuando la detección de pico 0,48 gramos de IL-8 blanco. (B) El bloqueo del resultado de la tensión del amplificador en dos análisis diferentes.

    El bloqueo del amplificador no detectó ninguna señal de que la muestra de control se puso a prueba. Este hecho, junto con la diferencia visual en la agregación sugiere que el sistema MMB puede identificar claramente la presencia de IL-8 blanco.

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    Discussion

    En resumen, hemos demostrado que el sistema de MMB se puede utilizar para detectar la presencia de IL-8 blanco a bajas concentraciones (0,5 pico gramos es el límite de detección de los ensayos de precisión Bio-Plex citoquinas Pro [3,4]). La capacidad del sistema no se limita a la IL-8 y se puede utilizar para detectar otras proteínas. Las ventajas del sistema de MMB son la capacidad de detectar el objetivo rápidamente y sin ningún tipo de separación o paso de lavado. Por lo tanto, facilita el proceso de detección y permite al sistema ser usado en aplicaciones de campo.

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    Disclosures

    Acknowledgements

    Este trabajo fue apoyado en parte por el Fondo Ishaya Horowitz.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Bio-Plex Pro Human Cytokine IL-8 set Bio-Rad 171-B5008M
    Recombinant human IL-8 target Thermo Fisher Scientific, Inc. R202625
    Biotinylated monoclonal mouse anti human IL-8 antibody G265-8 BD Biosciences 554718
    Streptavidin coupled fluorescent protein Bio-Rad Streptavidin PE

    References

    1. Danielli A., Arie A., Porat N., and Ehrlich M., "Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation", Optics Express, 16, 19253-19259 (2008).
    2. Danielli A., Porat N., Arie A., and Ehrlich M., "Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation", Biosensors and Bioelectronics, 25, 858-863 (2009).
    3. Bio-Plex Pro, Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel", http://www.cancer.dartmouth.edu/shared/Documents/HumanAngiogenesisKit.pdf.
    4. Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay, Instruction Manual, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA.

    Comments

    2 Comments

    In regards to the IL-8 Assay: [1] Did you have a specific concentration values on hand? [²] Is there a specific pH range that you used? [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 19, 2010, 2:26 PM

    Hi Michael,
    Here are the answers to your questions:
    [1] Did you have a specific concentration values on hand?

    We made several concentrations according to the Bio-Rad kit that we used. We chose to present the results with the smallest concentration that we made.

    [²] Is there a specific pH range that you used?

    We used the assay buffer of the kit. I guess that it had the optimal ph for the reaction.

    [3] How did you optimize so that the target antigen would bind to both the magnetic bead and the fluorescent protein?

    This kit is optimized already. You may check the reference list of the JoVE manuscript and see the kit&#x²019;s specifications. For further information on the MMB system as well as on the IL-8 kit, I suggest that you look at additional paper that we published: A. Danielli, N. Porat, M. Ehrlich, and A. Arie, &#x²01C;Magnetic modulation biosensing for rapid and homogeneous detection of biological targets at low concentrations&#x²01D;, Current Pharmaceutical Biotechnology, 11, 1²8-137 (²010)

    Best regards,

    Amos Danielli
    Reply

    Posted by: Amos D.November 2, 2010, 3:44 PM

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