JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE General

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You have trial access to videos in this collection until May 31, 2014.

Automatic Translation

This translation into Italian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l'esame di danno neuronale

1, 1

1Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University School of Medicine

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Neuroscience. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.198.148.191, User IP: 54.198.148.191, User IP Hex: 918983871

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Il organoptypic dell'ippocampo modello cultura fetta è un

    Date Published: 10/28/2010, Issue 44; doi: 10.3791/2106

    Cite this Article

    Wang, Q., Andreasson, K. The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury. J. Vis. Exp. (44), e2106, doi:10.3791/2106 (2010).

    Abstract

    Organotipica cultura fetta ippocampo è un metodo in vitro per esaminare i meccanismi di danno neuronale, in cui l'architettura di base e la composizione dell 'ippocampo è relativamente preservata 1. Il sistema di coltura organotipica consente l'esame degli effetti neuronali, astrociti e microglia, ma come preparazione ex vivo, non affronta gli effetti del flusso sanguigno, o reclutamento di cellule infiammatorie periferiche. A tal fine, questo metodo cultura viene spesso utilizzato per esaminare lesioni eccitotossico e ipossia ai neuroni piramidali dell'ippocampo, ma è stato utilizzato anche per esaminare la risposta infiammatoria. Qui si descrivono i metodi per la generazione di culture fetta dell'ippocampo dal cervello di roditori dopo la nascita, l'amministrazione stimoli tossici per indurre danno neuronale, e il saggio e la morte dei neuroni dell'ippocampo quantificare.

    Protocol

    1. Preparazione

    Prima di iniziare, montare gli strumenti chirurgici necessari, dissezione e terreni di coltura, e 7 giorni vecchio topo o cuccioli di topo. Il protocollo è lo stesso per il mouse e preparati ratto.

    (I) Materiali e attrezzature

    • Forbici operativo (dritto lunghezza 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
    • Micro dissezione forbici, (lunghezza 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
    • Acciaio al carbonio Dumont Pinzetta (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
    • Modificato vetro "trasferimento" pipette (in fondo alla pipetta Pasteur rimosso e levigato bordo)
    • Aclar pellicola di plastica tagliata a 2 "in x 2" nelle piazze (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA)
    • Copertura spugne 4 in da 3 a (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA)
    • 30 millimetri inserti membrana Millicell (0,4 micron; Millipore, Bedford, MA)
    • Mcllwain chopper tessuto a doppio taglio con lama di rasoio (chopper tessuto McIlwain, Società Vibratome, St. Louis, MO)
    • Microscopio invertito con telecamera CCD e software di analisi dell'immagine

    (Ii) Medio Dissection (DM; 1 litro a pH 7,3)

    Sale bilanciata di Hank 1 flacone (95,2 g/1L) (Sigma: H2387)
    NHCO 3 (4,2 mm) 350 mg
    HEPES (10 mM) 2,83 g
    Glucosio (33,3 mM) 6,0 g
    Penicillina / streptomicina (100x) 10 mL
    BSA (0,3%) 300 mg
    MgSO 4-7H 2 O 1,44 g

    (Iii) di media cultura (400 ml)

    MEM (Invitrogen 11575-032) 200 mL
    *** Hank Salt Balance (Invitrogen 24020-117) 100 ml
    Siero di cavallo (Invitrogen 26050-070) 100 ml
    HEPES tampone (1 M; Invitrogen 15630-080) 5 ml
    Penicillina / streptomicina (100x) 4 mL
    *** Aggiungere 12,8 g di glucosio a Salt Balance 500 ml di Hank prima di fare un terreno di coltura

    (Iv) gli animali

    7 giorni vecchio topo o cuccioli di topo postnatale, in genere una cucciolata per esperimento.

    2. In occasione della Giornata della Cultura

    1. Tutti gli strumenti di dissezione e film Aclar devono essere immersi nel 70% ETOH per 30 minuti prima dell'inizio. La superficie del cofano dissezione, lama, e chopper di tessuto devono essere disinfettate con etanolo.
    2. Preparare diversi (3-4) 6 pozzetti coltura tissutale; aggiungere 1 ml terreno di coltura per bene, e inserire una membrana permeabile Millipore in ciascun pozzetto. Posto a 6 pozzetti nel 37 ° incubatore fino al momento di trasferire fette.
    3. Preparare diversi (4-6) 60 mm con piastre di DM e posto sul ghiaccio.
    4. Rapidamente decapitare con le forbici e tuffo nel 70% ETOH, e rapidamente esporre il cervello con un incisione sagittale del cranio. Rimuovere con cura il cervello e il posto immediatamente a freddo DM. Separato in due emisferi e porre ogni lato mediale emisfero in giù su una spugna copertina per 2-3 secondi.
    5. Sollevare delicatamente e luogo nell'emisfero sulla piazza pellicola Aclar e luogo l'elicottero del tessuto; tagliare il cervello coronale in 350 sezioni micron. Al termine, dolcemente prendere la piazza Alcar con l'emisfero sezionato e immergere in acqua fredda DM.
    6. Utilizzando un microscopio da dissezione, separare le sezioni dell'ippocampo. Per ratto, ci dovrebbe essere 5 sezioni di ippocampo spanning rostrale caudale, e per il mouse ci dovrebbe essere sezioni 3-4.
    7. Estrarre il 6-pozzetti con inserti membrana dal 37 ° tessuto cultura incubatore. Trasferimento fettine di ippocampo individualmente sulle membrane permeabili con la pipetta di trasferimento di vetro. Se troppo DM viene rilasciato sulla membrana, DM rimuovere l'eccesso con una pipetta Pasteur. Luogo cinque fettine di ippocampo su ogni membrana. Lasciare almeno 3 pozzi per condizione o 15 fette.
    8. Incubare le piastre di coltura a 37 ° in un incubatore CO 5% umidificata per 12-14 giorni prima di iniziare l'esperimento tossicità. Il terreno di coltura può essere cambiato due volte la settimana.

    3. Indurre e Quantificare ippocampale danno neuronale nella cultura Slice

    1. Dopo 12-14 giorni di cultura, aggiungere 5 mg / ml di ioduro di propidio (PI) per terreni di coltura. Questo passo permetterà la visualizzazione e la quantificazione della morte delle cellule basali.
    2. Il giorno seguente, quantificare PIfluorescenza nella subregione CA1 (e / o CA3 dentato o se lo si desidera) di ogni fetta e dell'ippocampo significa ottenere le misure PI fluorescenza rappresenta la morte delle cellule basali (indicato come tempo = 0 ore, o T 0). Per l'acquisizione delle immagini e quantificazione, si usa il software OpenLab (improvvisazione, Regno Unito), ma l'acquisizione di immagini e altri software di analisi può essere utilizzato per quantificare l'intensità di fluorescenza.
    3. Immediatamente dopo l'acquisizione di immagini del T 0 PI fluorescenza, indurre danno neuronale dal metodo di scelta (abbiamo utilizzato 10 micron NMDA, deprivazione di ossigeno e glucosio, o LPS per un'ora per indurre tossicità neuronale 2,5). Dopo lo stimolo tossico, sostituire media con terreno fresco contenente 5 mg / ml PI e mantenere fette di notte.
    4. Il giorno 3, significa quantificare PI fluorescenza della condizione sperimentale in 24 ore, o T 24.
    5. Dopo questa acquisizione delle immagini, cambiare immediatamente medio e aggiungete 10 micron NMDA e 5 mg / ml PI e fette incubare una notte per raggiungere la massima morte neuronale.
    6. Il giorno 4, significa quantificare fluorescenza PI massima di morte neuronale, definita come T max. Calcolare la morte delle cellule per cento come segue: (T 24 - T 0) / (T max T-0).

    4. Rappresentante Risultati

    Figura 1
    Figura 1. (A) Linea Tempo per la generazione di dell'ippocampo e successive lesioni sperimentali e di acquisizione delle immagini. (B) immagini Rappresentante di fettine di ippocampo basale (T 0), 24 ore dopo una esposizione 1 ora per mM NMDA 10 (T 24), e dopo ulteriori 24 ore o 10 mM NMDA di ottenere la massima lesione neuronale (T max).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Ci sono due punti importanti da seguire per garantire risultati riproducibili e coerenti quando si replica esperimenti. In primo luogo, è importante lasciare che l'età dell'ippocampo fette per 12-14 giorni prima della sperimentazione. Con isolamento fetta, vi è una significativa risposta della microglia, e microglia rimangono attivi per un certo tempo, con un ritorno ad uno stato di riposo ramificata che si verificano di giorno 10 in vitro 3,6. In secondo luogo, intensità media PI fluorescenza è proporzionale al numero di cellule danneggiate 4. Fluorescenza sequenziale è misurato in tre punti di tempo: (i) a T 0, prima di NMDA o stimolazione OGD per misurare i livelli basali di morte neuronale spontanea, (ii) alla T 24, o 24 ore dopo stimolazione con NMDA o stimolo OGD o altro, e (iii) a T max, a seguito di un trattamento finale di fette con un trattamento di 24 ore durante la notte letale con 10 mM NMDA che produce la quantità massima di morte neuronale. La morte cellulare per cento viene quindi calcolato utilizzando la formula (T 24 - T 0) / (T max T-0). E 'fondamentale per normalizzare ogni fetta di se stesso utilizzando questo metodo perché le dimensioni dell'ippocampo e l'espressione dei recettori del glutammato e il cambiamento della distribuzione in maniera significativa come si va da rostrale al cervello caudale, e un fallimento per normalizzare ogni fetta a se stessa può provocare dati artefatta .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Nessun conflitto di interessi dichiarati.

    Acknowledgements

    Finanziato dal NINDS, American Heart Association, American Federation for Aging Research, March of Dimes

    References

    1. Stoppin, L., Buchs, P.A., & Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods 37(2),173 (1991).
    2. McCullough, L., Wu, L., Haughey, N., et al., Neuroprotective Function of the PGE2 EP2 Receptor in Cerebral Ischemia. J Neurosci 24 (1), 257 (2004).
    3. Czapiga, M., Colton, C.A. Function of microglia in organotypic slice cultures. J Neurosci Res 56, 644 (1999).
    4. Newell, D.W., Barth, A. Papermaster, V. et al. Glutamate and non-glutamate receptor mediated toxicity caused by oxygen and glucose deprivation in organotypic hippocampal cultures. J Neurosci 15 (11), 7702 (1995).
    5. Wu, L., Wang, Q., Liang, X. et al. Divergent Effects of prostaglandin recetor signaling on neuronal survival. Neuroscience letter 421(3), 253 (2007).
    6. Hailer, N.P., Jarhult, J.D., & Nitsch, R. Resting microglial cells in vitro: Analysis of morphology and adhesion molecule expression in organotypic hippocampal slice cultures. Glia 18, 319 (1996).

    Comments

    1 Comment

    Any tips for neuronal death quantifcation by propidium iodide? Thanks!
    Reply

    Posted by: FELIPE C.January 24, 2013, 1:17 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter