Il organotipica ippocampale Cultura Modello Slice per l'esame di danno neuronale

1. Preparazione

Prima di iniziare, montare gli strumenti chirurgici necessari, dissezione e terreni di coltura, e 7 giorni vecchio topo o cuccioli di topo. Il protocollo è lo stesso per il mouse e preparati ratto.

(I) Materiali e attrezzature

• Forbici operativo (dritto lunghezza 6 ", cat # RS6818, Roboz, Gaithersburg, MD)
• Micro dissezione forbici, (lunghezza 4 '", cat # RS5910. Roboz, Gaithersburg, MD)
• Acciaio al carbonio Dumont Pinzetta (cat # RS-5045.Roboz, Gaithersburg, MD)
• Modificato vetro "trasferimento" pipette (in fondo alla pipetta Pasteur rimosso e levigato bordo)
• Aclar pellicola di plastica tagliata a 2 "in x 2" nelle piazze (Honeywell, # 812071, Pottsville, PA)
• Copertura spugne 4 in da 3 a (Kendall, cat # 3157, Mansfield, MA)
• 30 millimetri inserti membrana Millicell (0,4 micron; Millipore, Bedford, MA)
• Mcllwain chopper tessuto a doppio taglio con lama di rasoio (chopper tessuto McIlwain, Società Vibratome, St. Louis, MO)
• Microscopio invertito con telecamera CCD e software di analisi dell'immagine

(Ii) Medio Dissection (DM; 1 litro a pH 7,3)

(Iii) di media cultura (400 ml)

(Iv) gli animali

7 giorni vecchio topo o cuccioli di topo postnatale, in genere una cucciolata per esperimento.

2. In occasione della Giornata della Cultura

1. Tutti gli strumenti di dissezione e film Aclar devono essere immersi nel 70% ETOH per 30 minuti prima dell'inizio. La superficie del cofano dissezione, lama, e chopper di tessuto devono essere disinfettate con etanolo.
2. Preparare diversi (3-4) 6 pozzetti coltura tissutale; aggiungere 1 ml terreno di coltura per bene, e inserire una membrana permeabile Millipore in ciascun pozzetto. Posto a 6 pozzetti nel 37 ° incubatore fino al momento di trasferire fette.
3. Preparare diversi (4-6) 60 mm con piastre di DM e posto sul ghiaccio.
4. Rapidamente decapitare con le forbici e tuffo nel 70% ETOH, e rapidamente esporre il cervello con un incisione sagittale del cranio. Rimuovere con cura il cervello e il posto immediatamente a freddo DM. Separato in due emisferi e porre ogni lato mediale emisfero in giù su una spugna copertina per 2-3 secondi.
5. Sollevare delicatamente e luogo nell'emisfero sulla piazza pellicola Aclar e luogo l'elicottero del tessuto; tagliare il cervello coronale in 350 sezioni micron. Al termine, dolcemente prendere la piazza Alcar con l'emisfero sezionato e immergere in acqua fredda DM.
6. Utilizzando un microscopio da dissezione, separare le sezioni dell'ippocampo. Per ratto, ci dovrebbe essere 5 sezioni di ippocampo spanning rostrale caudale, e per il mouse ci dovrebbe essere sezioni 3-4.
7. Estrarre il 6-pozzetti con inserti membrana dal 37 ° tessuto cultura incubatore. Trasferimento fettine di ippocampo individualmente sulle membrane permeabili con la pipetta di trasferimento di vetro. Se troppo DM viene rilasciato sulla membrana, DM rimuovere l'eccesso con una pipetta Pasteur. Luogo cinque fettine di ippocampo su ogni membrana. Lasciare almeno 3 pozzi per condizione o 15 fette.
8. Incubare le piastre di coltura a 37 ° in un incubatore CO 5% umidificata per 12-14 giorni prima di iniziare l'esperimento tossicità. Il terreno di coltura può essere cambiato due volte la settimana.

3. Indurre e Quantificare ippocampale danno neuronale nella cultura Slice

1. Dopo 12-14 giorni di cultura, aggiungere 5 mg / ml di ioduro di propidio (PI) per terreni di coltura. Questo passo permetterà la visualizzazione e la quantificazione della morte delle cellule basali.
2. Il giorno seguente, quantificare PIfluorescenza nella subregione CA1 (e / o CA3 dentato o se lo si desidera) di ogni fetta e dell'ippocampo significa ottenere le misure PI fluorescenza rappresenta la morte delle cellule basali (indicato come tempo = 0 ore, o T _0). Per l'acquisizione delle immagini e quantificazione, si usa il software OpenLab (improvvisazione, Regno Unito), ma l'acquisizione di immagini e altri software di analisi può essere utilizzato per quantificare l'intensità di fluorescenza.
3. Immediatamente dopo l'acquisizione di immagini del T ₀ PI fluorescenza, indurre danno neuronale dal metodo di scelta (abbiamo utilizzato 10 micron NMDA, deprivazione di ossigeno e glucosio, o LPS per un'ora per indurre tossicità neuronale ^2,5). Dopo lo stimolo tossico, sostituire media con terreno fresco contenente 5 mg / ml PI e mantenere fette di notte.
4. Il giorno 3, significa quantificare PI fluorescenza della condizione sperimentale in 24 ore, o T _24.
5. Dopo questa acquisizione delle immagini, cambiare immediatamente medio e aggiungete 10 micron NMDA e 5 mg / ml PI e fette incubare una notte per raggiungere la massima morte neuronale.
6. Il giorno 4, significa quantificare fluorescenza PI massima di morte neuronale, definita come T _max. Calcolare la morte delle cellule per cento come segue: (T ₂₄ - T ₀₎ / (T _{max T-0).}

4. Rappresentante Risultati

Figura 1. (A) Linea Tempo per la generazione di dell'ippocampo e successive lesioni sperimentali e di acquisizione delle immagini. (B) immagini Rappresentante di fettine di ippocampo basale (T _0), 24 ore dopo una esposizione 1 ora per mM NMDA 10 (T _24), e dopo ulteriori 24 ore o 10 mM NMDA di ottenere la massima lesione neuronale (T _max).

Ci sono due punti importanti da seguire per garantire risultati riproducibili e coerenti quando si replica esperimenti. In primo luogo, è importante lasciare che l'età dell'ippocampo fette per 12-14 giorni prima della sperimentazione. Con isolamento fetta, vi è una significativa risposta della microglia, e microglia rimangono attivi per un certo tempo, con un ritorno ad uno stato di riposo ramificata che si verificano di giorno 10 in vitro ^3,6. In secondo luogo, intensità media PI fluorescenza è proporzionale al numero di cellule danneggiate ^4. Fluorescenza sequenziale è misurato in tre punti di tempo: (i) a T _0, prima di NMDA o stimolazione OGD per misurare i livelli basali di morte neuronale spontanea, (ii) alla T _24, o 24 ore dopo stimolazione con NMDA o stimolo OGD o altro, e (iii) a T _max, a seguito di un trattamento finale di fette con un trattamento di 24 ore durante la notte letale con 10 mM NMDA che produce la quantità massima di morte neuronale. La morte cellulare per cento viene quindi calcolato utilizzando la formula (T ₂₄ - T ₀₎ / (T _{max T-0).} E 'fondamentale per normalizzare ogni fetta di se stesso utilizzando questo metodo perché le dimensioni dell'ippocampo e l'espressione dei recettori del glutammato e il cambiamento della distribuzione in maniera significativa come si va da rostrale al cervello caudale, e un fallimento per normalizzare ogni fetta a se stessa può provocare dati artefatta .