JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Russian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

Хроматин Иммунопреципитация Пробирной для тканеспецифические Гены использованием ранней стадии эмбрионы мыши

1, 1, 1

1Department of Cell Biology, University of Massachusetts Medical School

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Biology. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.234.74.85, User IP: 54.234.74.85, User IP Hex: 921324117

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    Мы демонстрируем иммунопреципитации хроматина (чип) метод идентификации факторных взаимодействий в тканях специфических генов во время или после наступления тканеспецифические экспрессии генов в тканях мышей в зачаточном состоянии. Этот протокол должен быть широко применяется для изучения тканеспецифические активации генов, как это происходит во время нормального эмбрионального развития.

    Date Published: 4/29/2011, Issue 50; doi: 10.3791/2677

    Cite this Article

    Cho, O. H., Rivera-Pérez, J. A., Imbalzano, A. N. Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos. J. Vis. Exp. (50), e2677, doi:10.3791/2677 (2011).

    Abstract

    Хроматин иммунопреципитации (чип) является мощным инструментом для определения белка: хроматина взаимодействий, которые происходят в контексте живых клеток 1-3. Эта техника была широко использована в клетках тканевой культуры, и в меньшей степени, в первичных тканей. Применение чипа грызунов эмбриональной ткани, особенно на ранних времен развития, осложняется ограниченным количеством ткани и гетерогенность клеточной и тканевой типы в зародыше. Здесь мы представляем метод для выполнения чипов с помощью эмбриональных диссоциированных день 8,5 (E8.5) эмбриона. Стриженый хроматина из одного E8.5 эмбриона можно разделить на срок до пяти аликвоты, которая позволяет следователю достаточно материала для элементов управления и для исследования специфического белка: хроматина взаимодействий.

    Мы использовали эту технику, чтобы начать документа белка: хроматина взаимодействий в спецификации тканеспецифические программ экспрессии генов. Неоднородность типов клеток в эмбрионе обязательно ограничивает применение этого метода, поскольку в результате обнаружения белка: хроматина взаимодействия без выделения ли взаимодействия происходят во всех, подмножество, или одного типа клеток (ы). Тем не менее, исследование тканей определенных генов во время или после начала тканеспецифические экспрессии гена возможна по двум причинам. Во-первых, иммунопреципитации ткани специфические факторы обязательно изолирует хроматина от типа клеток, где фактор выражается. Во-вторых, иммунопреципитации коактиваторов и гистонов содержащие пост-трансляционной модификации, которые связаны с активацией генов должно быть найдено только на гены и регуляторные последовательности гена в клетке типа, где ген или были активированы. Техника должна быть применима к изучению наиболее тканеспецифические события активации генов.

    В примере, описанном ниже, мы использовали E8.5 и эмбрионов мыши E9.5 для изучения связывания факторов в скелетных мышцах конкретного промотора гена. Сомитов, которые предшественник ткани, из которой скелетных мышц туловища и конечностей образуют, присутствуют на E8.5-9.5 4,5. Myogenin является регулирующим фактором, необходимых для скелетных мышц дифференциации 6-9. Данные показывают, что myogenin связан с собственным промоутером в E8.5 и E9.5 эмбрионов. Потому что myogenin выражается только в сомитов на данном этапе развития 6,10, данные показывают, что myogenin взаимодействия со своими промоутером уже имели место в скелетных мышцах клеток-предшественников в E8.5 эмбрионов.

    Protocol

    1. Выделение Эмбрионы

    Примечание: Все операции, связанные с мышами должны быть выполнены в соответствии с надлежащего ухода и использования животного политику и протоколы

    1. Проверить наличие спаривания подключить мышь женского пола утром после спаривания и отдельных повязана самок из стада мужчин, помещая их в различные клетки. Полдень в день, что ответным штепселем наблюдается считается день эмбрионального 0,5 (E0.5) развития.
    2. На E8.5 (или желаемый этап, если отличается), жертвенность мыши, используя утвержденным протоколом.
    3. Влажные живот эвтаназии животных с 70% этанола и открытой брюшной полости. Имплантация сайты указывающих на наличие развивающиеся эмбрионы рассматриваются как "бусы на строку" договоренность по длине каждого рога матки (рис. 1А). Использование ножницы, удалить оба рога матки, разрезать каждый имплантации индивидуально для разделения (рис. 1В) и поместите их в 100 мм чашки Петри содержащие комнатной температуре (RT) рассечение среды (DMEM, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 20 мМ HEPES рН 7,4 , 60 мкг / мл пенициллина, стрептомицина, 2 мМ).
    4. Использование пинцета, извлекайте каждый эмбрион и окружающие мембраны из ткани матки (рис. 1C) и поместите их в свежую среду рассечение.
    5. Изоляция отдельных эмбрионов при вскрытии микроскопом использованием щипцов. На данном этапе развития, эмбрионы окружены теменной желточного мешка, который контактирует deciduum тканей, внутренних органов желточного мешка и амнион. Амниона представляет собой прозрачную мембрану, которая находится в непосредственном контакте с эмбрионом. Висцерального желточный мешок расположен между амнион и мешок теменной желток и легко отличается в E8.5-E9.5 эмбрионов на наличие известных кровеносных сосудов, которые питают эмбриона. Удалить каждый эмбрион от окружающей его оболочки и передачу индивидуально в новую пластину, содержащую вскрытия средств массовой информации, чтобы удалить лишнюю кровь. Стадии развития может варьироваться от эмбриона эмбриона, а также между пометов, представитель E8.5 эмбрионов и эмбрионов представитель E9.5 показаны на рис 1D.
    6. Передача каждого эмбриона 1,5 мл Eppendorf пробирку, содержащую 200 мкл рассечение СМИ (описанных в пункте 4 выше).

    2. Усреднение Изолированные эмбрионов

    1. Добавить 20 единиц коллагеназы типа II в объеме 200 мкл (разводится в фосфат 1X Dubbecco в солевом буфере; DPBS) в каждую пробирку Эппендорф.
    2. Осторожно встряхните образцов в 37 ° C шейкере при 100 оборотов в минуту в течение 20 мин.
    3. Ресуспендируют также с помощью пипетки сорвать скопления клеток.
    4. Применение клеточной суспензии в верхней части стерильных сито ячейка (40 мкм размер ячейки), размещенные на 1,5 мл трубки Эппендорф.
    5. Сразу же применить 600 мкл комнатной температуре 1X DPBS на верхней части ячейки фильтра для завершения разделения. Отменить фильтр.
    6. Центрифуга образцов при 4 ° С при 4000 мкг в течение 5 мин.
    7. Удалите супернатант.
    8. Ресуспендируют гранул в 1 мл РТ DPBS 1X.
    9. Центрифуга образцы при 4000 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре.
    10. Удалите супернатант.
    11. Ресуспендируют осадок в 200 мкл среды РТ рассечение.
    12. Граф эмбриональных клеток. Существует среднем 3-5 х 10 6 cells/E8.5 эмбриона.

    3. Перекрестная ссылка хроматина

    1. Добавить 5,6 мкл 37% формальдегида в 200 мкл образцов для конечной концентрации 1% формальдегида.
    2. Инкубируйте образцы в течение 10 мин при комнатной температуре.
    3. Центрифуга образцов при 4 ° С при 4000 мкг в течение 3 мин.
    4. Удалите супернатант.
    5. Ресуспендируют клетки с холодной 1X DPBS содержащей 80 мкл / мл коктейля ингибитор протеазы (ПОС).
    6. Центрифуга образцов при 4 ° С при 4000 мкг в течение 3 мин.
    7. Удалите супернатант. На этом этапе образцы могут быть заморожены при температуре -80 ° C. Замороженные, сшитые образцы стабильны в течение нескольких месяцев.

    4. Разрушение ультразвуком

    1. Ресуспендируют осадок клеток в 100 мкл RT SDS лизирующего буфера (50 мМ Трис-HCl (рН 8,1), 10 мМ ЭДТА и 1% SDS с только что добавил ПИК в 1 мкл PIC/800 мкл общего объема). Когда ресуспендировали, добавить еще 100 мкл буфера для лизиса РТ SDS содействовать ресуспендирования. Хорошо перемешать с помощью пипетки и инверсии.
    2. Инкубируйте клеточной суспензии на льду в течение 10 мин.
    3. Разрушать ультразвуком лизировали клетки сдвига ДНК, чтобы между 200 и 500 пар оснований использованием Diagenode Bioruptor ™ UCD200 (5 мин х 8 раз: амплитуда установка 30 сек on/30 сек прочь на высоком (320 Вт) мощности). Образцы должны быть окружены льду суспензии. Не допускайте, чтобы нагреть образцы выше 4 ° С или заморозить. Есть много типов sonicators доступны. Ультразвуком условия должны быть оптимизированы для каждого sonicator привести к стрижка сшитого ДНК длиной около 500 пар оснований.
    4. Центрифуга ультразвуком образцов при температуре 4 ° С при 14 000 мкг в течение 10 мин.
    5. Тransfer супернатант в новую пробирку Эппендорфа предварительно охладить на льду.
    6. Разделите ультразвуком образца в максимум 5 аликвоты. У нас есть эмпирически установлено, что один E8.5 эмбриона можно разделить на 5 порций. Меньший или больший размер выборки можно масштабировать соответственно. На этом этапе образцы могут храниться при температуре -80 ° C до последующего использования.
    7. Резервный один аликвоту для использования в качестве входных данных и хранить при температуре -20 ° С до шага 6, когда перекрестные ссылки будут обращены вспять. Развести другие аликвоты 10-кратный в чип буфера разбавления (16,7 мМ Трис-HCl (рН 8,1), 1,2 мМ ЭДТА, 1,1% Тритон Х-100, 167 мМ NaCl и 0,01% SDS), содержащий только что добавил ПИК на 1 μl/800 мкл буфера.

    5. Предварительная очистка и Иммунопреципитация

    1. Предварительно ясно разбавленной надосадочной с 75 мкл Лосось-спермы ДНК / белка или G агарозном-50% раствора при температуре 4 ° С, с вращением, в течение 1 часа. Использование либо белков или бусы Protein G должна определяться антитела, которые будут использоваться для чип. Например, белковые гранулы рекомендуется для кролика антител, в то время как белок G бисер рекомендуется для козьих антител или мыши IgG 1 антител. Для получения более подробной информации см. рекомендации производителя шарик.
    2. Центрифуга при 4 ° С при 2500 мкг в течение 1 мин.
    3. Передача супернатант на новый, предварительно охладить пробирку Эппендорфа.
    4. Добавить антител (4 мкг / образец), чтобы предварительно очищен аликвоту и инкубировать в течение ночи при 4 ° С с вращением.

    6. Стиральная Хроматин-белок-бусинка комплекс

    1. Добавить 60 мкл ДНК спермы лосося / Белок или G агарозном суспензии в каждую пробирку и инкубируют при 4 ° С с вращением в течение 1 часа. Используйте те же шарик тип используется для предварительной очистки в шаге 3 выше.
    2. Центрифуга при 4 ° С при 1000 мкг в течение 1 мин.
    3. Осторожно удалите супернатант и выбросьте. Держите ДНК-белок-бусинка комплекса на льду.
    4. Ресуспендируют и промыть осадок, как указано ниже промывочным буферов 1, 2, 3 и 4. Вымойте буферов 1-3 должны быть охлажденными до 4 ° C и моет эти буферы должны быть выполнены при 4 ° C. Промывочного буфера 4 следует при комнатной температуре и смывает с этого буфера должны быть выполнены при комнатной температуре. Каждая промывка в течение 5 минут с вращением при соответствующей температуре. После каждого мытья, центрифуги при 4 ° С (комнатной температуре в течение промывочного буфера 4 моет) при 1000 мкг в течение 1 мин, затем аккуратно аспирата или удалить супернатант.

    Буфер 1: Низкая промывочный буфер соли (20 мМ Трис-HCl (рН 8,1), 2 мМ ЭДТА, 1% Triton X-100,
    150 мМ NaCl и 0,1% SDS), 1 мл х 2 стирок.
    Буфер 2: Высокое промывочный буфер соли (20 мМ Трис-HCl (рН 8,1), 2 мМ ЭДТА, 1% Triton X-100,
    500 мМ NaCl и 0,1% SDS), 1 мл х 2 стирок.
    Буфер 3: LiCl соль промывочного буфера (10 мМ Трис-HCl (рН 8,1), 1 мМ ЭДТА, 1% Igepal-CA630,
    0,25 М LiCl и 1% deoxycholic кислотой (натриевая соль)), 1 мл х 1 стирки.
    Буфер 4: ТЕ-буфера (10 мМ Трис-HCl (рН 8,1), 1 мМ ЭДТА), 1 мл х 2 стирок.

    7. Элюирование Хроматин-антитело

    1. Ресуспендируют мыть хроматин-белок-бусинка комплекс в 250 мкл свежеприготовленного буфера элюирования (1% SDS, 0,1 М NaHCO 3). Энергично вихрь образца в течение 5 сек, то инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин с вращением.
    2. Центрифуга при 2500 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре и передача элюата в трубку новые Эппендорф.
    3. Повторите шаги 1 и 2 и объединить элюатов в той же пробирке Эппендорф. Элюатов должны храниться при комнатной температуре. После завершения этого шага, элюатов могут храниться при температуре -20 ° C до последующего использования.

    8. Обратный кросс-ссылки и восстановление ДНК

    1. Добавьте 20 мкл 5 М NaCl в течение 500 мкл элюата (40 мкл / мл для входного контроля).
    2. Тепло элюатов при 65 ° С на водяной бане в течение 4 часов, чтобы за одну ночь.
    3. 10 мкл каждого образца (в том числе входного контроля) может быть запущен на 2% агарозном геле рядом с размером маркеры охватывающей 0,1 до 1 кб, чтобы проверить размер фрагмента ДНК. ДНК будет выглядеть как мазок, а не резким группы. Остальные образцы можно оставить на 65 ° С, в то время как гель работает.
    4. Восстановление ДНК из каждого образца с помощью QIAquick Гель Добыча Kit (Qiagen). Добавить 600 мкл буфера QG (поставляется в комплекте) для оптимизации ДНК адсорбции с кремнеземом мембраны в колонке QIAquick спина и 200 мкл изопропанола в 500 мкл образца. Обратите внимание, что буфер содержит QG рН индикатор позволяет легко определять рН образца. Если цвет образца оказывается от желтого до фиолетового (рН> 7,5) после смешивания, добавить 10 мкл 3 NaAcetate М (рН 5,2) к образцу и перемешать. Это снижает рН смеси до максимального связывания ДНК с бисером в столбце.
    5. Перед загрузкой колонки, проверьте смесь определить, является ли какой-либо осадок SDS присутствует. Если SDS осадков произошло, образец должен быть нагрет в42 ° С водяной бане, пока осадок не исчезнет.
    6. Нагрузка 700 мкл смеси в колонке QIAquick спина (фиолетовый столбец в комплект) и центрифуги при комнатной температуре на 14 000 мкг в течение 1 мин. Откажитесь от потока через колонку с прежде чем продолжить и повторить этот шаг с остальной части образца.
    7. Добавить 500 мкл буфера QG мыть колонке. Центрифуга при комнатной температуре на 14 000 мкг в течение 2 мин. Откажитесь от потока через колонку с прежде чем продолжить.
    8. Промыть колонку с 700 мкл промывочного буфера PE (поставляется в комплекте), к которому этанола была добавлена ​​в соответствии с инструкциями производителя. Центрифуга при комнатной температуре на 14 000 мкг в течение 1 мин. Откажитесь от потока через колонку с прежде чем продолжить.
    9. Повторите шаг центрифугирования, чтобы полностью удалить оставшуюся часть буфера PE из колонки. Откажитесь от потока через и пробирки.
    10. Элюции ДНК из колонки в новую пробирку Эппендорф, добавляя 60 мкл буфера EB (элюирование буфера поставляется в комплекте).
    11. Центрифуга при комнатной температуре на 14 000 мкг в течение 1 мин. Элюируют ДНК можно хранить при температуре от -20 ° C до обнаружения. 260 показания извлеченных материалов обычно указывают концентрации 90-120 нг / мкл, для полного восстановления ~ 6-7 мкг в аликвоту. Тем не менее, 260/280 соотношение этих образцов, как правило,> 1,8, предполагая, что РНК присутствуют в образце. Таким образом, точное количество восстановленных ДНК может быть ниже.

    9. Анализ ДНК Восстановленные

    1. СДС может вмешиваться в деятельность полимеразы Taq ПЦР. ИКБ должна быть полностью удалены перед выполнением ПЦР. Инкубируйте ДНК на льду для осаждения остаточного SDS и центрифуги при 4 ° С при 14 000 мкг в течение 1 мин. Передача супернатант на новую ступень Эппендорф tube.This настоятельно рекомендуется.
    2. ДНК элюатов могут быть обнаружены либо обычными ПЦР или количественного ПЦР в реальном времени (Q-ПЦР) с праймерами, специфичными для каждой последовательности для анализа. 5-10 мкл элюата от общего ДНК может быть использован для одной ПЦР или Q-PCR реакции. ПЦР с входной контроль может осуществляться с 5-10 раз разведения ДНК по сравнению с количеством других образцов. ПЦР и Q-PCR условия будут меняться, однако, ограниченное количество исходного материала требует дополнительных циклов ПЦР. Для обычных обнаружения ПЦР, мы рекомендуем начать с 40 циклов и корректировки по мере необходимости.

    10. Представитель Результаты

    Мы использовали этот протокол для выполнения чип от обоих E8.5 и E9.5 эмбрионов (рис. 2). Результаты показывают, что myogenin присутствует на myogenin промотора в E8.5 и E9.5 эмбрионов. ChIP ДНК, очищенная анализировали с помощью обычной ПЦР (рис. 2А) и количественный ПЦР в реальном времени (рис. 2В). В отличие от этого, не было никаких признаков myogenin привязки к myogenin промотора в желточный мешок, где myogenin не выражен. Интерферона-γ (IFNγ) промоутер, который содержит последовательности, соответствующие myogenin сайт связывания, был использован в качестве отрицательного контроля последовательности. Как и ожидалось, myogenin не был связан с IFNγ промоутером в одном из образцов ткани проверены. В E8.5 и 9,5 эмбрионов, myogenin специально выражается в сомитов (рис. 3, 6,10), которые являются предшественниками скелетных мышцах. Таким образом, результаты показывают, что myogenin обязан myogenin промотора в сомитов на E8.5 и E9.5.

    Рисунок 1
    Рисунок 1. E8.5 эмбриона рассечение. (А) Изолированные рога матки (верхняя панель; большем увеличении показано на нижней панели). (B) роге матки разрезать ножницами для разделения отдельных сайтов, содержащих отдельные имплантации эмбрионов. (C) Эмбрионы торчащих из ткани матки во время вскрытия. Стрелками эмбрионов до сих пор покрыта экстра-эмбриональной ткани. (D) два E8.5 эмбрионов из одного помета. Эмбриона на левом еще не начался процесс превращения. Эмбриона на правом проходит поворот. Дальний правый - представитель эмбриона E9.5.

    Рисунок 2
    Рисунок 2. ChIP анализ демонстрирует myogenin привязки к myogenin промотора в E8.5 и E9.5 эмбрионов. (Вверху) Обычные анализ ПЦР из 5 мкл ДНК очищали от ChIP экспериментов с использованием myogenin антител или неспецифических IgG проводили с праймерами, которые усиливают часть myogenin промоутер от -79 до +69 относительно начала сайта транскрипции, что содержит myogenin сайт связывания расположен на -12 или праймеры, которые усиливают часть IFNγ промоутер, который содержит последовательность соответствующих myogenin сайт связывания расположен ~ 1075 б.п. вверх по течению от места старта транскрипции. IFNγ грунтовки последовательности были использованы 5'-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 'и 5'-GGA TGA TGG GGC AGG AGG CC-3'. (Внизу) Количественный ПЦР в реальном времени анализ тех же образцов, используемых в (А).Данные приведены в% от вход + / - стандартное отклонение.

    Рисунок 3
    Рисунок 3. Myogenin специально выражается в сомитов из E8.5 и E9.5 эмбрионов. Всего монтировать на месте гибридизация myogenin показывает конкретное выражение мРНК в сомитов. Размер бар в E8.5 изображение - 200 мкм. Размер бар в E9.5 изображение - 500 мкм.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    В описанных ChIP протокол, мы покажем, что миогенной myogenin регулятор связан с myogenin промоутер в ткани скелетных мышц предшественником присутствует в одном E8.5 и E9.5 эмбрионов. До исследования широко характеризуется myogenin привязка к E коробке, содержащей последовательности, начиная с начальной в пробирке гель сдвиг экспериментов использования в пробирке переведена или бактериально производится myogenin и радиоактивной ДНК, кодирующей соответствующей части гена-мишени регуляторных последовательностей 11-20. Обычные исследования показали, ChIP myogenin привязки к myogenin промоутер в моделях культуры тканей для myogenesis 21-24. Тем не менее, нет никаких доказательств того, что показывает, что myogenin связывается с myogenin промоутер во время эмбрионального развития скелета мышцы, хотя можно было бы предсказать, что это будет позже в случае эмбриогенеза на основе вниз регулирования myogenin выражении наблюдалась в E15.5 язык ткани myogenin дефицитных мышей 25. Таким образом, данные свидетельствует о том, что взаимодействие между myogenin и myogenin взаимодействия промоутер происходит в естественных условиях. Очевидное применение этого метода является использование его для проверки физиологическое значение предыдущих исследований характеризующих тканеспецифические ткани активации генов осуществляется с помощью культуры моделей. Более интересные приложения использовать эту технику в качестве части первоначального характеристика новых или ранее неохарактеризованных фактор, чтобы определить физиологическое значение специфического взаимодействия до выполнения культуре ткани исследований, направленных на понимание функциональных mechanisms.The протокол может быть также использована для непосредственно сравнить белка: хроматина взаимодействий, происходящих на определенных этапах своего развития в мышиных моделей, содержащих разработаны генетические манипуляции.

    Мы ожидаем, что этот метод также будет полезна для временного хода исследования тканеспецифические регуляции генов во время развития. По оценке конкретного фактора: хроматина взаимодействия на разных этапах эмбрионального, можно было бы определить момент времени, при котором фактор взаимодействия впервые происходит, может определить, является ли взаимодействие сохраняется в течение и после процесса дифференцировки или более преходящий характер, и может определить Порядок связывания факторов, если несколько факторов взаимодействуют с определенной последовательности. Наконец, мы представляем себе, что протокол может быть продлен до повторного ChIP процедуры 26 котором хроматин восстановленные из одного иммунопреципитации подвергается второй иммунопреципитации с антителами против различных факторов считается совместно занимающие же участок хроматина. Повторно ChIP протокол обеспечивает более убедительных доказательств того, что две различные факторы присутствуют в той же части хроматина, вероятно, требование для этой модификации будет увеличение количества исходного материала.

    Замечательное понимание того, что пришло от наших усилий было то, что ограниченное количество исходного материала не была препятствием к успеху, что можно было предсказать, особенно учитывая, что ткань культуры клеток протоколы часто предлагают, начиная с однородным населением миллионы или десятки миллионов клетками 26,27. Успех наших усилий, говорит с первичным (и неконтролируемых) требование для антител, способных конкретных иммунопреципитации фактор под следствием. Как только антитела определены как способные иммунопреципитации, следователь может оптимизировать ChIP анализа путем титрования количество антител используется. Важно отметить, что больше не всегда означает лучше, и мы часто находим, что слишком много антител, особенно с образцами ограниченном количестве, приводит к более высоким фоном привязки к последовательности не имеет значения. Кроме того, использование иммуноглобулина фракций или аффинно очищенные антитела часто приводит к снижению фона, чем использование сыворотки. Фон из-под контроля антител часто может быть оценена путем включения образца, содержащего бисером без каких-либо антител.

    Мы заключаем, что с помощью ранних эмбрионов для чипа этапе анализа белка: хроматина взаимодействий, которые происходят во время активации тканеспецифические гены есть потенциал, чтобы обеспечить значительно углубить понимание индукции и поддержания тканей конкретных программ экспрессии генов непосредственно в контексте развития .

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Университета штата Массачусетс медицинской школы IACUC.

    Acknowledgements

    Эта работа была поддержана NIH R01 GM56244 в Ани, который включает в себя средства награждены через оздоровлении американской экономики и реинвестировании 2009 года, а по НИЗ R01 GM87130 к Jarp

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    ChIP Assay Kit Upstate, Millipore 17-295
    Collagenase Type II Invitrogen 17101015 Dilution by 1 x PBS
    Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) GIBCO, by Life Technologies 12100-061 High glucose content
    Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) GIBCO, by Life Technologies 14190-144 Calcium chloride free, Magnesium chloride free
    Fetal bovine serum (FBS) Mediatech, Inc. 35-010-CV
    Gel extraction kit QIAquick 28704 50 reaction kit
    Penicillin/streptomycin stock solution GIBCO, by Life Technologies 5000 μg/ml concentration
    Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich P8340
    Salmon sperm DNA /Protein A agarose EMD Millipore 16-157
    myogenin antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-576
    Normal rabbit IgG EMD Millipore 12-370
    Platinum PCR Supermix Invitrogen 11306-016
    GoTaq Q-PCR master mix Promega Corp. A6001

    References

    1. Minard, M. E., Jain, A. K. & Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis 47, 559-572 (2009).
    2. Kuo, M. H. & Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods 19, 425-433 (1999).
    3. Johnson, K. D. & Bresnick, E. H. Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. Methods 26, 27-36 (2002).
    4. Yusuf, F. & Brand-Saberi, B. The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl) 211 Suppl 1, 21-30 (2006).
    5. Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D. & Relaix, F. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat 202, 59-68 (2003).
    6. Wright, W. E., Sassoon, D. A. & Lin, V. K. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cell 56, 607-617 (1989).
    7. Edmondson, D. G. & Olson, E. N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program. Genes Dev 3, 628-640 (1989).
    8. Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S. & Nonaka, I. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature 364, 532-535 (1993).
    9. Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N. & Klein, W. H. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature 364, 501-506 (1993).
    10. Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H. & Buckingham, M. Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis. Nature 341, 303-307 (1989).
    11. Brennan, T. J. & Olson, E. N. Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization. Genes Dev 4, 582-595 (1990).
    12. Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T. & Arnold, H. H. A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors. Nucleic Acids Res 18, 6239-6246 (1990).
    13. Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E. & Arnold, H. H. Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer. Eur J Biochem 198, 187-193 (1991).
    14. Chakraborty, T., Brennan, T. & Olson, E. Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding. J Biol Chem 266, 2878-2882 (1991).
    15. French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N. & Schwartz, R. J. Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter. Mol Cell Biol 11, 2439-2450 (1991).
    16. Brennan, T. J., Chakraborty, T. & Olson, E. N. Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 5675-5679 (1991).
    17. Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D. & Weintraub, H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell 66, 305-315 (1991).
    18. Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D. & Olson, E. N. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cell Biol 11, 3633-3641 (1991).
    19. Cserjesi, P. & Olson, E. N. Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products. Mol Cell Biol 11, 4854-4862 (1991).
    20. Braun, T. & Arnold, H. H. The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties. Nucleic Acids Res 19, 5645-5651 (1991).
    21. de la Serna, I. L., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J. & Imbalzano, A. N. MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex. Mol Cell Biol 25, 3997-4009 (2005).
    22. Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y. & Dynlacht, B. D. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes Dev 19, 553-569 (2005).
    23. Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A. & Tapscott, S. J. Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters. EMBO J 25, 502-511 (2006).
    24. Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T. & Imbalzano, A. N. Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis. J Biol Chem 282, 6564-6570, (2007).
    25. Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R. & Klein, W. H. Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle. Dev Biol 311, 650-664 (2007).
    26. Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M. & Gannon, F. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell 115, 751-763 (2003).
    27. Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. & Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology. (John Wiley & Sons, Inc., 2010).

    Comments

    4 Comments

    Dear authors, in step 3.-5. of the Chromatin IP protocol (both in the video and the print version. The protocol says to Resuspend the cells with cold 1x DPBS containing 80 ul/ml protease inhibitor cocktail. However, it is unclear how much cold DPBS is required to resuspend each sample. Also, 80ul/ml is a very high concentration of PIC in comparison to all other steps using PIC. I just wanted to make sure this isn't a typo before I attempt to start my experiment. Thank you, Lara
    Reply

    Posted by: Lara C.September 27, 2012, 6:36 PM

    Hi Lara,
    We resuspended in ²00 microliters. Regarding the protease inhibitor cocktail, we diluted the stock 1 to 1².5. For the indicated steps, we used 80ul of the diluted PIC per ml of buffer. Thanks for asking for clarification of these steps. I hope this addresses your questions. Tony Imbalzano
    Reply

    Posted by: Anthony I.September 28, 2012, 2:11 PM

    Thanks Tony,
    Still setting up to start optimizing conditions for my E11.5 embryos flank tissue. I noticed that you did not add glycine to stop fixation after cross-linking with formaldehyde. Is there any particular reason you don't use glycine?Also, I was wondering if you have ever tried your protocol on embryos older than E8.5 and might have additional suggestions for me. Hope to hear from you...Lara
    Reply

    Posted by: Lara C.October 2, 2012, 2:12 PM

    Hi Lara,
    The first author determined it was not necessary to add glycine. However, you certainly can use it, and others in the lab have chosen to use glycine at this step.
    We used the same protocol on E9.5 embryos. This was indicated in section 10 of the protocol and data from both E8.5 and E9.5 embryos are presented in Figure ².
    In earlier work, we performed ChIP on E10.5 embryos (head and internal organs removed), on E1².5 embryos (limb buds) and E14.5 (limb skeletal muscle, or liver or brain as a control). The citations are Ohkawa et al, EMBO J ²5:490, ²006 and Ohkawa et al, JBC ²8²:6564, ²007.

    Best wishes,
    Tony Imbalzano
    Reply

    Posted by: Anthony I.October 8, 2012, 2:23 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter