Création fractures Rigidement stabilisées pour l'évaluation de l'ossification intramembranaires, ostéogenèse par distraction, ou de guérison des défauts critiques Sized

Toutes les procédures ont été approuvées par le soin des animaux UCSF institutionnel et l'utilisation Comité et se conformer aux directives nationales.

1. Préparation de fixateurs avant la chirurgie

1. Avant de créer une fracture stabilisée, il faut assembler le dispositif sur mesure de conception de fixation externe. Les cadres de fixation sur mesure conçus externes se composait de deux anneaux d'aluminium stabilisés par trois en acier inoxydable # 0/56 tiges filetées, 8 # 2/56 écrous hexagonaux, boulons et 17 correspondants (Partie Petit Inc, Miami Lakes, Floride ^3).
2. Deux anneaux en aluminium sont nécessaires par fracture. Pour assembler une bague 4 # 2/56 écrous hexagonaux (Partie petite Inc, Miami Lakes, Floride) et des boulons correspondants dans les trous appropriés, ceux-ci devraient rester lâche. Ce sera l'anneau proximal. Pour l'anneau distal assembler 3 écrous et boulons, encore une fois ne pas serrer à fond.

2. Anesthésie, fracture de création, et fixateur demande

1. Souris (âge, sexe, et le corpspoids sont déterminés par l'utilisateur) sont anesthésiés par injection intrapéritonéale de kétamine 50mg/ml, 0,5 mg / ml médétomidine (0,03 ml / souris).
2. Appliquer du lubrifiant oeil aux yeux des souris et placez un morceau de ruban adhésif sur leur tête pour protéger leurs yeux lors de la procédure.
3. L'animal est placé sur un bloc de chauffage pour le reste de la procédure.
4. Transfix les métaphyses proximales et distales du tibia gauche en utilisant quatre broches 0,25 mm insecte stérile (Anticorro: Outil belle science, Foster City, CA) en attachant les chevilles à un outil de Dremel et les percer à travers l'os.
5. Repères sont orientés perpendiculairement à l'axe long du tibia, et 90 ° par rapport à l'autre. Au moins 10 mm entre les repères de proximale et distale.
6. Placez le premier anneau au-dessus des broches proximales avec les écrous vers l'intérieur, vers les broches. Fixer les broches à l'anneau de maintien du tibia en position centrale au sein de l'anneau en aluminium.
7. Placez le second anneau en dessous de la dibroches Stal et sécuriser les broches à l'anneau à l'aide des écrous hexagonaux comme avant. Ajouter le quatrième écrou-boulon combinaison de la partie distale du fixateur.
8. Créer la fracture transversale par flexion trois points avec un dispositif approprié. Nous utilisons le système de gravité de Bonnarens et Einhorn ^4. Reste la surface postéro-du tibia à travers les blocs, augmenter le poids à une hauteur prédéterminée le long du bras de chute et laisser tomber le poids de telle sorte qu'il en contact avec la face antéro-externe du tibia pour produire la fracture brutale. La hauteur du poids est passé de besoins doit être déterminée pour chaque souche de souris pour assurer une seule fracture du tibia exclusivement.
9. Fracture est confirmée par X-ray.
10. Après confirmation de la fracture, trois acier inoxydable # 0/56 tiges filetées sont fixés aux anneaux. À partir de l'extrémité distale de la tige et insérer enfiler un écrou sur la bague distale pour bloquer la tige. Ensuite, mettez une autre écrou sur la tige, l'anneau proximal va s'asseoir sur le dessus de ce nut. Veiller à ce que les deux anneaux se tiendra à égale distance et ne sont pas forcer les broches. Fixez l'anneau proximal aux tiges avec un écrou tiers.
11. Injections sous-cutanées de la buprénorphine (1,0 mg / kg) pour l'analgésie sont donnés immédiatement après la chirurgie et les animaux sont surveillés pour la douleur et la buprénorphine donnée au besoin.
12. L'anesthésie est renversée par l'administration atipamézole, et les animaux sont surveillés jusqu'à ce qu'ils soient adaptés et ambulante.

3. Ostéogenèse par distraction (voir aussi: ^12,13)

Pour modifier cette procédure pour accueillir la distraction osseuse est simple. Les anneaux sont maintenus en position par des tiges filetées, et en faisant tourner les écrous de maintien des crayons à la place des anneaux peuvent être écartés.

1. Latence: Pour la distraction norme ostéogenèse utilisant ce modèle, les fixateurs sont placés sur le tibia et le laissé seul pendant une période de latence de 5 jours.
2. Distraction: osteog distractionenesis peut être effectué en tournant les écrous sur les tiges de stabilisation tour ¼ (0,25 mm) tous les 7 jours jours.
3. Elevage: Bony pontage est observé par 10 jours et la consolidation complète est observée par 27 jours après la fin de la distraction.

4. Création d'un défaut critique entreprises

Pour créer un défaut critique de taille des fixateurs externes sont appliquées comme décrit précédemment avec les modifications suivantes.

1. Avant de commencer la procédure de la peau est nettoyée avec de l'éthanol 70%.
2. Les fixateurs sont appliqués complètement avant de créer le défaut.
3. La souris est ensuite placer sous la loupe binoculaire pour visualiser le tibia médial, et une incision (5-7 mm) est réalisé avec une lame # 10 sur un scalpel.
4. Le muscle est sectionné et délicatement séparés pour exposer la mi-diaphyse du tibia.
5. Un segment de 3 mm de l'os est ensuite retiré de la paire de ciseaux à mi-diaphyse à l'aide. Utilisation de til pointe des ciseaux, l'os est lentement ciselée loin et fragments d'os sont enlevés avec une pince si nécessaire. Des précautions doivent être prises avec les conseils des ciseaux pour éviter de déplacer le tibia avec une grande force mécanique.
6. Examiner le site chirurgical pour assurer qu'il n'y a pas de fragments d'os, comme ceux-ci pourraient favoriser la guérison.
7. Remplacer le muscle autour des extrémités émoussées du tibia.
8. Fermer l'incision sur la peau avec 2-3 points de suture de 6-0 monofilament polyamine.
9. L'anesthésie est inversée et les animaux sont suivis pour la douleur et des analgésiques donnée comme décrit précédemment.

5. Les résultats représentatifs

Lorsqu'il est correctement appliqué, les fixateurs externes fournissent une plus grande stabilité rigide de la fracture fermée du tibia avec une excellente réduction (fig. 1, 2). Toutefois, dans certains cas, une réduction insuffisante (une lacune évidente et importante entre les extrémités osseuses ou des fractures multiples se produisent (Fig. 3 (Fig. 4). En revanche, si la fracture n'est pas stabilisé un cal cartilage grande est formée dans le fossé fracture (Fig. 5), et il est remplacé par de l'os à travers le processus d'ossification membraneuse.

Figure 1. Radiographies illustrant un dispositif de fixation externe pour stabiliser une fracture du tibia. Radiographie prise après une fracture de montrer quelques segments d'os bien alignées (tête de flèche).

Figure 2. Image d'une souris après le fixateur a été appliquée.

Figure 3. Radiographie prise après fracture montre segments osseux mal alignées et fragmentée (tête de flèche).

Figure 4. Fracture guérit stabilisé par l'intermédiaire d'ossification membraneuse. Coloration trichrome de fracture stabilisée montre un peu d'os nouveau (b) au site de la fracture. Échelle = 500 um.

Figure 5. Non-stabilisé fracture guérit par l'intermédiaire d'ossification endochondrale. Coloration trichrome de fracture non stabilisée montre cartilage (c) et de l'os (b) au site de fracture. Échelle = 500 um.

Bones guérir par deux modalités différentes en fonction de la stabilité mécanique (revue dans: ^14). Quand on le laisse quelques grandes formes instables modèle du cartilage dans l'espace de fracture qui est remplacé par de l'os pour combler les deux extrémités de l'os cassé. Proximale et distale à la pause, l'os forme directement par l'ossification intramembranaire dans le périoste et endoste. En revanche, dans la guérison des fractures stables se fait exclusivement par l'intermédiaire d'ossification intramembranaire ^3. Cependant, les mécanismes spécifiques qui régissent la transition entre ces deux processus ne sont pas connus. Il existe des preuves que le destin des cellules souches en réponse à l'environnement mécanique est commandé génétiquement et peuvent être modifiés. Chez les souris qui n'ont pas de MMP9 formes du cartilage dans le site de la fracture de fractures stables ce qui suggère que la MMP9 est impliqué dans les décisions sur les cellules souches sort pendant ⁵ réparation d'une fracture. Le cartilage peut aussi être amené à former dans les fractures stables si la protéine morphogénétique osseuse(BMP) la voie de signalisation est activé au cours de ^8,9 réparation d'une fracture. Afin de tirer ces conclusions assurant une stabilisation rigide pendant les premiers stades de la guérison est important, parce que ces décisions sur les cellules souches sort sont effectués pendant les premiers jours après la lésion ^11.

Notre méthode de fixation externe, lorsqu'il est appliqué correctement peut être utilisé pour stabiliser l'os afin d'évaluer l'ossification intramembranaire pendant la guérison des fractures. Notre méthode crée une fracture avec les blessures des membres d'autres qui se produisent dans un choc à grande vitesse. En revanche, les modèles de trous de forage qui sont utilisés pour évaluer l'ossification intramembranaire peuvent ne pas refléter les traumatismes chez les patients. En outre, la méthode décrite ici est fermé, donc les complications associées à une blessure ouverte ne confondent l'interprétation des résultats. Une autre méthode commune pour la stabilisation utilise le placement d'un clou intramédullaire avant de se fracturer (par exemple ^4). Cette technique est largement utilisée, et le placement des ee broches est simple et efficace. Bien que cette approche produit stabilisation latérale il ne fournit pas à la stabilité de rotation. La blessure guérit résultant principalement par l'ossification endochondrale qui peut être atteint sans une stabilisation à tous les ^3. Fixation plaqué a également été utilisé pour parvenir à une stabilisation de fracture chez la souris ^15. Ici une fracture ouverte est créé et spécialement conçus fixateurs internes sont fixées à l'os après une ostéotomie est faite. Semblable à notre approche, la méthode de fixation interne assure la stabilité et la guérison se fait par l'ossification membraneuse. Nous n'observons pas de complications importantes, broches infections des voies, ou d'autres co-morbidités associées à cette procédure, et les animaux sont capables de se déplacer facilement leurs cages. Les inconvénients majeurs sont la longueur du temps qu'il faut pour devenir compétent dans cette méthode, le temps qu'il faut pour terminer la procédure, et l'obligation pour les équipes de deux personnes pour effectuer la procédure. Jecombinaison avec n manipulations génétiques ou physiologiques à des souris, en comparant stabilisée à la guérison des fractures non-stabilisée donne un aperçu considérable dans les mécanismes qui régulent le destin des cellules souches pendant ⁵ guérison des fractures, et a permis une enquête sur la distraction osseuse ^14, tandis que également nous fournir une modèle de non-union ^13.