JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of Developmental Biology

You have subscription access to videos in this collection through your user account.

Automatic Translation

This translation into Norwegian was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

Identifisering og karakterisering av protein glykosylering med bestemte endo-og exoglycosidases

1, 1, 1

1New England Biolabs

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Med bestemte glycosidases å fjerne sukker fra glykoproteiner etterfulgt av SDS-PAGE er en verdifull metode for å detektere glycan modifikasjoner på protein prøver og er et godt valg for første glycobiology studier. Endringer følgende deglycosylation kan oppdages som endringer i gel mobilitet eller ved farging med glycan sensitive reagenser.

    Date Published: 12/26/2011, Issue 58; doi: 10.3791/3749

    Cite this Article

    Magnelli, P. E., Bielik, A. M., Guthrie, E. P. Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases. J. Vis. Exp. (58), e3749, doi:10.3791/3749 (2011).

    Abstract

    Glykosylering, tillegg av kovalent bundet sukker, er en stor posttranslasjonelle modifisering av proteiner som kan påvirke prosesser som celle adhesjon, molekylær menneskehandel, fortolling, og signaltransduksjon 1-4. I eukaryoter, de vanligste glykosylering modifikasjoner i sekretoriske veien er tilleggene i konsensus aspargin rester (N-linked), eller ved serin eller treonin rester (O-forbundet) (figur 1). Oppstart av N-glycan syntese er svært bevart i eukaryoter, mens sluttproduktene kan variere sterkt mellom de ulike artene, vev, eller proteiner. Noen glykaner forblir uendret ("high mannose N-glykaner") eller er videre behandlet i Golgi ("komplekse N-glykaner"). Større mangfold er funnet for O-glykaner, som starter med en felles N-Acetylgalactosamine (GalNAc) rester i animalske celler, men skiller seg i lavere organismer 1.

    ent "> The detaljert analyse av glykosylering av proteiner er et felt for seg selv og krever store ressurser og kompetanse til å gjennomføre skikkelig. imidlertid en rekke tilgjengelige enzymer som fjerner sukker (glycosidases) gjør det mulig å ha en generell idé om glykosylering status . et protein i et vanlig laboratorium innstilling Her skal vi illustrere bruken av glycosidases for analyse av en modell glykoprotein. rekombinant humant choriongonadotropin beta (hCGβ), som bærer to N-glykaner og fire O-glykaner 5 Teknikken krever bare enkel instrumentering og typiske forbruksvarer, og det kan lett tilpasses til analyse av flere glykoprotein prøver.

    Flere enzymer kan brukes parallelt for å studere et glykoprotein. PNGase F er i stand til å fjerne nesten alle typer av N-koblede glykaner 6,7. For O-glykaner, er det ingen tilgjengelig enzym som kan holde seg intakt oligosakkarid fra the protein ryggrad. I stedet er O-glykaner beskåret exoglycosidases en kort kjerne, som deretter lett fjernes ved O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix inneholder PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), β1-4 Galactosidase, og β-N-Acetylglucosaminidase. Den brukes til å samtidig fjerne N-glykaner og noen O-glykaner 8. Til slutt ble Deglycosylation Mix supplert med en blanding av andre exoglycosidases (α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, α1-3, 6 Galactosidase og β1-3 Galactosidase), som bidra til å fjerne ellers motstandsdyktig monosakkarider som kan være til stede i visse O-glykaner.

    SDS-PAGE/Coomasie blå brukes til å visualisere forskjeller i protein migrasjon før og etter glycosidase behandling. I tillegg viser en sukker-spesifikk farging metoden, ProQ Emerald-300, svekket signal som glykaner er successively fjernet. Denne protokollen er designet for analyse av små mengder glykoprotein (0,5 til 2 mikrogram), selv om enzymatisk deglycosylation kan skaleres opp til å romme større mengder protein etter behov.

    Protocol

    1. Enzymatisk deglycosylation

    1. Bruk PCR rør for å redusere vanntap på grunn av fordampning. Etikett ett sett med rør 1-7.
    2. Tine 10X G7 buffer, den 10X glykoprotein denaturing buffer, og 10% NP-40 og banke forsiktig på rørene for å blande innholdet. Oppbevares ved romtemperatur.
    3. Plasser enzymet inneholder hetteglass på is. Prøv å minimere tine / fryse sykluser.
    4. Løs opp innholdet i hCGβ hetteglass (150 mikrogram) i 600 mL av dH 2 O og holde på is.
    5. Forbered 1 ml 1X G7 buffer ved å fortynne 10X lager i dH 2 O.
    6. Fortynn 0,5 mL av PNGase F i 25 mL 1X G7 buffer og holde på is.
    7. Klargjør exoglycosidase mix (EG mix) ved å kombinere 2 mL hver av α-N-Acetylgalactosaminidase, α1-2 Fucosidase, β1-3 Galactosidase, og α1-3, 6 Galactosidase.
    8. Sett opp PCR rør som angitt:
    ak ">
    Tube / sample # 1 2 3 4 5 6 7
    hCGβ (0.25mg/ml) 9μl 9μl 9μl 9μl - - -
    10X Glykoprotein denaturering Buffer 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl 1μl
    dH 2 O - - - - 9μl 9μl 9μl
    1. Cap rørene, bland forsiktig og plasser ithermocycler, lukk lokket og denaturerer proteiner ved incubating 10 minutter ved 94 ° C, etterfulgt av en 4 ° C hold (ved hjelp av PCR rør i en thermocycler sterkt hindrer fordamping i små volum prøver).
    2. Fjern rørene fra thermocycler og sentrifuger for å fjerne eventuelle synlige kondens.
    3. Legg til følgende reagensene som angitt:
    Sample # 1 2 3 4 5 6 7
    10% NP-40 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl
    10X G7 Buffer 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2.5μl 2,5 og mu; L 2.5μl
    PNGase F 01:50 DIL. - 2μl - - 2μl - -
    Deglycosylation Mix - - 2μl 2μl - 2μl 2μl
    EG mix - - - 2μl - - 2μl
    dH 2 O 10μl 8μl 8μl 6μl 8μl 8μl 6μl
    Total reaksjon vol. 25 μ l 25 μ l 25 μ l 25 μ l </ Td> 25 μ l 25 μ l 25 μ l
    1. Lukk PCR rør med ny caps (kast de brukte dem fordi de ikke passer ordentlig etter at en inkubering syklus).
    2. Bland rørene ved å forsiktig trykke fire ganger og deretter spinne innholdet ned.
    3. Plasser rørene i thermocycler og inkuber ved 37 ° C i 4 timer så kult prøvene til 4 ° C.

    2. SDS-PAGE av deglycosylated prøver

    1. Forbered 130 mL frisk 3X redusere SDS lasting buffer ved å legge 4 mL av 1,25 m DTT.
    2. Legg til 12,5 mL av den tilberedte 3X redusere SDS lasting buffer til hver prøve.
    3. Lukk rør med nye caps og banke forsiktig på rørene å blande.
    4. Inkuber rørene i en thermocycler ved 94 ° C i 5 minutter og deretter avkjøles til 4 ° C.
    5. Load 30 mL av hver prøve og 10 mL av protein markør på en 10-20% Tris-Glycine gel. Spar resten av utvalget for del 3.1. Load 10μl av ColorPlus Prestained Protein Marker.
    6. Electrophorese gelen ved 130 volt i romtemperatur inntil fargestoff fronten er nær bunnen av gelen.
    7. Når geleen er ferdig, fjern gel fra kastet og legg den i en liten plastboks med nok Coomasie blå flekken for å dekke gel.
    8. Stain gelen for 1 time med forsiktig omrøring.
    9. Vask gel tre ganger i 30 minutter i 50 ml destain løsning.
    10. Ta opp bildene ved hjelp av en hvit lys transilluminator eller skanner. Alternativt kan gel tørkes mellom ark av cellofan i en ramme.

    3. Pro-Q Emerald 300 for påvisning av glykosylert proteiner i SDS-PAGE gels

    1. Parallelt med gel i 2.1), belastning på resten av prøvene på en 10-20% Tris-Glycine gel. Load 10 & mu; L ColorPlus Prestained Protein Marker.
    2. Mens gel kjører oppløse Pro-Q Emerald reagens med DMF og forberede aksjen Fix, Vask og Oksiderende løsninger for Pro-Q Emerald 300 flekken etter produkt manual følger med settet.
    3. Når elektroforese er fullført, fjerner gel fra oppleggskanten og plassere den i en plastboks.
    4. Fix gelen ved å tilsette 100 ml av Fix løsning og la den ligge over natten i romtemperatur med forsiktig omrøring.
    5. Vask gelen med 100 ml av Wash løsningen i 10 til 20 minutter i romtemperatur med gentile agitasjon. Gjenta vask med friske Vask løsning.
    6. Oksidere karbohydrater ved inkubasjon gelen med forsiktig omrøring i 30 minutter i 25 ml Oksiderende løsning.
    7. Vask gelen som beskrevet i trinn 3.5.
    8. Mens gel er å vaske forberede frisk Pro-Q Emerald 300 flekken ved å tilsette 500 mL av Pro-Q Emerald 300 reagens løsning oppløst i trinn 3,2 til 25 mlflekker buffer gitt i settet.
    9. Stain gelen ved å tilsette 25 ml av flekken utarbeidet i steg 3.8 og inkubasjon i mørke med forsiktig omrøring i 90 til 120 minutter.
    10. Gjenta de to vaske trinnene som er beskrevet i trinn 3.5.
    11. Ta bildene med en UV transilluminator på 300nm. Bruk de 80 kDa markør, som er merket med Pro-Q Emerald Green, å overlappe UV bildet til et hvitt lys bilde av gel viser prestained stigen.
    12. Sammenlign bilder av Coomasie stained gel i takt 2.10 med Pro-Q Emerald stained gel fra punkt 3.11.

    Fire. Representative resultater

    Endringene i protein migrasjon etter enzymatisk deglycosylation er vist i figur 2. Sammenlign kontrollutvalget (panel A, 1 kjørefelt) med PNGase F behandling (fjerning av N-glykaner, 2 kjørefelt), og Deglycosylation Mix (PNGase F, pluss endo-og exoglycosidases å fjerne O-glykaner, kjørefelt 3). Ingen ytterligere reduksjoni størrelse er sett etter fordøye med ekstra glycosidases (lane 4). Foruten en endring i masse, band blir skarpere som glykaner fjernes. Et band som kjører under 17 kDa markør (stjerne) representerer det fullt deglycosylated hCGβ polypeptid (MW: 16 kDa). Andre band kan stamme fra ufullstendig deglycosylation eller fra flere uidentifiserte proteiner tilstede i hCGβ utvalget (se felt 1). Lanes 5-7 (kontroller) viser båndene som tilsvarer glycosidases.

    Den glykoprotein flekker av Emerald Green er vist i panel B. Denne reagensen oxidizes og flekker alle glykaner stede i et protein molekyl. Derfor intensiteten på signalet avtar som hCGβ er enzymatisk deglycosylated (lane 1 til lane 4). Den gjenværende signal i felt 3 og 4 indikerer tilstedeværelse av glycan motiver, som er resistente mot de enzymene som brukes. Den ekstra glycosidases brukes i kjørefelt fire fjerne et par ekstra sukker rester: protein migrasjon er den samme, menen svak reduksjon i intensitet i flekker kan ses. Resistent sukker moieties var ikke til stede i alle protein arter: noen band ikke ble oppdaget av Emerald Green (fraværende i UV bildet, i parentes), som indikerer at de i utstrakt grad ble deglycosylated. Ytterligere data støtter konklusjonen om at hCGβ er heterogent glykosylert. Den nedre bandet på lane 2 (pil) er svak på den smaragdgrønne bildet, mens den øvre bandet på lane 2 er lyse, noe som indikerer at mange glykaner grupper er fortsatt til stede. Disse dataene støtter den konklusjon at rekombinante hCGβ uttrykt i mus cellene inneholder flere glycoforms 9. Disse ulike glycoforms skyldes iboende heterogenitet av glykosylering hvor noen polypeptider ikke får en glycan i hvert konsensus område og / eller noen glykaner er utvidet mens andre selv på samme protein er det ikke.

    Figur 1
    Figur 1.Typiske glykosylering mønstre for secreted eller celle-overflate glykoproteiner.

    Figur 2
    Figur 2. SDS-PAGE gels viser enzymatisk deglycosylation av hCGβ. Panel A viser en Coomasie blå flekker mens Panel B viser resultatene av Pro-Q Emerald 300 for visualisering av glykosylert proteiner. Eksempel nummer: 1, hCGβ kontroll, 2, PNGase F fordøyelsen; 3, Deglycosylation Mix fordøyelsen, 4, Deglycosylation Mix pluss exoglycosidases fordøyelsen, prøver 5-7 er reagenset kontroller (O-Glyc, O-Glycosidase; GNA, β-N -Acetylglucosaminidase; Gal / Fuc, β1-3 Galactosidase, α1-3, 6 Galactosidase og α1-2 Fucosidase; GalNA, α-N-Acetylglalactosaminidase, Neu, Neuraminidase; PNGase; PNGase F)

    Discussion

    Metoden som beskrives her bruker enzymatisk deglycosylation og SDS-PAGE kan gi verdifull informasjon om glykosylering tilstand av et protein av interesse, mens glycan-spesifikke reagenser lette tolkningen av dataene. Denne protokollen er ment for den innledende studier av protein glykosylering og det er særlig egnet for sekretoriske og membran glykoproteiner fra mammalske celler: enzymer valgt i dette tilfellet vil spesifikt fjerne alle N-glykaner, og eller N-glykaner pluss og de ​​vanligste sukker utvide og danner kjernen i O-glykaner. Glycosidases har den ekstra fordelen av å være mild, sammenlignet med kjemiske deglycosylation metoder, bevare integriteten av både sukker og protein ryggrad.

    Å belyse frekvensen av belegg (som aminosyrer er glykosylert), omfanget av glykosylering, eller å bestemme den fine strukturen av glykaner, mer sofistikerte teknikker som mass spektrometri, væskekromatografi eller NMR er påkrevd.

    På grunn av sin enkelhet, kan flere trinn i denne protokollen justeres, erstattes, og / eller kombineres for å imøtekomme ulike eksperimentelle behov. Men for å oppnå resultater som kan være tydelig tolket det er viktig å forstå dets styrker og begrensninger. Først den spesifisitet og renhet glycosidases er avgjørende: bare godt karakterisert enzymer testet for å være fri for proteaser og andre forurensende aktiviteter bør brukes. Dessverre finnes det ingen standard enzyme enhet definisjon for glycosidases, bør brukeren bestemme riktig substitusjon i henhold til produsentens spesifikasjoner. Sekund, er en forsiktig valg av deteksjon nødvendig: a) Protein flekker reagenser er nyttig bare hvis deglycosylation resulterer i en betydelig endring i molekylvekt. Et slikt klart resultat som vist her, er ikke alltid innhentes. I andre tilfeller har vi sett unormal miinnvandring etter deglycosylation (langt fra den anslåtte molekylvekt, eller enda langsommere migrasjon). Dette fenomenet er ikke godt forstått, men det kan sies at enhver endring i migrasjon er bevis på at protein har blitt deglycosylated. B) Sugar deteksjon med antistoffer gir unike utfordringer som begrenser deres egnethet. Det har vært veldig vanskelig å skape en generell anti-glycan antistoffer, de er vanligvis reist mot en kompleks glycan mål, noe som begrenser deres bruk. Dessuten flere monoklonale anti-glycan antistoffer vise uønsket kryssreaksjon 10. Er c) Lektiner (proteiner med iboende sukker affinitet) velegnet for sukker deteksjon, pluss at de gir innsikt på glycan struktur. Men ikke alle av dem har en smal spesifisitet, og mange er bare delvis karakterisert (som betyr at de kunne ha ukjent slektskap). Som en konsekvens positiv lektin flekker gir indikasjon, ikke bevis, av tilstedeværelsen av en GIVen sukker. d) Kjemisk merking kits (basert på periodate oksidering av sukker) er metoden for valg å farge alle glykoproteiner, og dermed godt egnet til å følge deglycosylation.

    Ved behandling av en ukjent prøve, er det en god praksis å inkludere glykoprotein kontroller. Fetuin er en lett tilgjengelig N - og O-glykoprotein; choriongonadotropin (begge subenheter) er også et godt valg. Bovine serum albumin (BSA) kan brukes som en negativ kontroll. Imidlertid bør det bemerkes at noen ikke-glykosylert proteiner reagerer litt med Pro-Q Emerald 300, spesielt når det brukes i høye konsentrasjoner. Ikke-glykosylert molekylvekt standarder, slik som prestained protein markør som brukes i denne protokollen, har fordelen av å vise skarpe band. Kun ved en tilfeldighet er ett av disse proteinene (80 kDa) reaktiv til Pro-Q Emerald 300. Derfor kan det hende at brukeren ønsker å kjøre en glykoprotein standard stige i stedet, slik som Candy-Cane fra Invitrogen.

    Endelig er enkel i-gel påvisning av nucleocytosolic glykoproteiner (som er modifisert med en enkelt O-GlcNAc) mulig med bruk av et monoklonalt antistoff, langs β-N-Acetylglucosaminidase for spesifisitet kontroll 11. Beskrivelsen av denne teknikken er utenfor omfanget av denne artikkelen, men det bør nevnes som glycosidases er nyttige verktøy for studier av mange andre glykoproteiner og glycoconjugates stede i celler. En omfattende behandling av alle kjente former for glykosylering kan bli funnet i den andre utgaven av "Essentials of glycobiology", tilgjengelig gratis på nettet ved NCBI Bokhylle (Bookshelf ID: NBK1908; PMID: 20301239) 12.

    Disclosures

    Forfatterne er ansatt ved New England Biolabs, som produserer mange av reagenser som brukes i denne artikkelen.

    Acknowledgements

    Don Comb

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Human chorionic gonadotropin β Sigma-Aldrich C6572
    PCR Tubes VWR international 20170-004
    PCR Thermocycler Applied Biosystems 4359659
    PNGase F New England Biolabs P0704 Supplied with buffers
    Protein Deglycosylation Mix New England Biolabs P6039 Supplied with buffers
    α-N-Acetylglalactosaminidase New England Biolabs P0734 Supplied with buffer
    α1-2 Fucosidase New England Biolabs P0724 Supplied with buffer
    α1-3,6 Galactosidase New England Biolabs P0731 Supplied with buffer
    β1-3 Galactosidase New England Biolabs P0726 Supplied with buffer
    10X Buffer G7 (500 mM Sodium Phosphate) New England Biolabs --- Supplied with PNGaseF or Degl Mix
    10X Glycoprotein Denaturing Buffer (5% SDS, 400 mM DTT) New England Biolabs --- Supplied with PNGaseF or Degl Mix
    10% NP-40 New England Biolabs --- Supplied with PNGaseF or Degl Mix
    3X SDS loading buffer (187.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 6% SDS, 30% glycerol, 0.03% bromophenol blue) New England Biolabs B7703 Supplied with 1.25M DTT
    ColorPlus Prestained Protein Marker New England Biolabs P7709
    10-20% Tris-Glycine Multigel Cosmo Bio Co. DCB-414893
    Cassette Electrophoresis Unit Cosmo Bio Co. DCB-303111
    Electrophoresis Power Supply EPS 301 GE Healthcare 18-1130-01
    Pro-Q Emerald 300 Glycoprotein Stain Kit Invitrogen P-21857
    Brilliant Blue R Sigma-Aldrich B0149
    AlphaImager HP System Cell Biosciences 92-13823-00

    References

    1. Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12, (4), 43-56 (2002).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease. Cell. 126, 855-867 (2006).
    3. Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins. Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).
    4. Mitra, N., Sinha, S., Ramya, T. N. C., Surolia, A. N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function. Trends in Biochemical Sciences. 31, 156-163 (2006).
    5. Carlsen, R. B., Bahl, O. P., Swaminathan, N. Human chorionic gonadotropin. Linear amino acid sequence of the beta subunit. Journal of Biological Chemistry. 248, (19), 6810-6812 (1973).
    6. Tarentino, A. L., Plummer, T. H. Deglycosylation of Asparagine-linked Glycans by PNGaseF. Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 5, (23), 163-170 (1993).
    7. Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1-3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199, 647-652 (1991).
    8. Koutsioulis, D., Landry, D., Guthrie, E. P. Novel endo-α-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity. Glycobiology. 18, (10), 799-805 (2008).
    9. Thakur, D. Profiling the glycoforms of the intact alpha subunit of recombinant human chorionic gonadotropin by high-resolution capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81, (2), 8900-8907 (2009).
    10. Park, S., Lee, M. R., Shin, I. Carbohydrate microarrays as powerful tools in studies of carbohydrate-mediated biological processes. Chemical Communications. 37, 4389-4399 (2008).
    11. Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine. Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).
    12. Varki, A. Essentials of Glycobiology. Clod Spring Harbor Laboratory Press (2008).

    Comments

    1 Comment

    I Appreciate all the team and contributors of the JOVE for excellent knowledge and journal
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 27, 2011, 2:58 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter