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 JoVE Biology

Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene

1, 1,2,3, 1

1Department of Biophysics and Biophysical Chemistry, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, 3Department of Physics, Jilin University

Article
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    Summary

    Se describe un método de microscopía de fluorescencia, co-translacional de activación por escisión (COTRAC), a la imagen de la producción de moléculas de proteína en células vivas con precisión una sola molécula sin perturbar la funcionalidad de la proteína. Este método se ha utilizado para seguir la dinámica de expresión estocásticos de un factor de transcripción, el λ represor CI

    Date Published: 3/15/2013, Issue 73; doi: 10.3791/50042

    Cite this Article

    Hensel, Z., Fang, X., Xiao, J. Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC). J. Vis. Exp. (73), e50042, doi:10.3791/50042 (2013).

    Abstract

    Se describe un método de microscopía de fluorescencia, co-translacional de activación por escisión (COTRAC) a la imagen de la producción de moléculas de proteína en células vivas con precisión una sola molécula sin perturbar la funcionalidad de la proteína. Este método hace posible contar el número de moléculas de proteína producida en una célula durante las ventanas secuenciales, el tiempo de cinco minutos. Se requiere un microscopio de fluorescencia con una densidad de potencia del láser de excitación de ~ 0,5 a 1 kW / cm 2, que es suficientemente sensible para detectar moléculas individuales de proteínas fluorescentes en células vivas. El reportero fluorescente usada en este método se compone de tres partes: una secuencia de dirección de membrana, una maduración rápida, proteína fluorescente amarilla y una secuencia de reconocimiento de proteasa. El reportero está fusionado traduccionalmente al extremo N-terminal de una proteína de interés. Las células se cultivan en una platina de microscopio de temperatura controlada. Cada cinco minutos, moléculas fluorescentes dentro de las células se crean imágenes (y más tarde coUnted mediante el análisis de imágenes de fluorescencia) y posteriormente photobleached modo que las proteínas recién traducido sólo se cuentan en la siguiente medición.

    Imágenes de fluorescencia resultante de este método se puede analizar mediante la detección de manchas fluorescentes en cada imagen, asignándolos a las células individuales y luego asignar células a linajes celulares. El número de proteínas producidas dentro de una ventana de tiempo en una célula dada se calcula dividiendo la intensidad integrada de fluorescencia de las manchas por la intensidad media de las moléculas fluorescentes individuales. Se utilizó este método para medir los niveles de expresión en el intervalo de 0-45 moléculas individuales en 5 min ventanas de tiempo. Este método nos permitió medir el ruido en la expresión del represor CI λ, y tiene otras muchas aplicaciones potenciales en la biología de sistemas.

    Protocol

    1. Strain Engineering Workflow

    1. Inserto que codifica secuencias de (a) una secuencia de localización de membrana, (b) una proteína fluorescente de maduración rápida y (c) una secuencia de reconocimiento de la proteasa N-terminal a y en marco con una proteína de interés (por ejemplo, un factor de transcripción). Se utilizó la membrana dirigida TSR-Venus reportero 2 y fusionado a la secuencia de reconocimiento de la proteasa ubiquitina (Ub) para contar el número de expresadas bacteriófago λ represor CI moléculas de proteína. Los detalles sobre cómo se construyó la proteína de fusión TSR-Venus-Ub-CI, en sustitución de la de tipo salvaje CI región de codificación y la incorporación del constructo en la E. coli cromosoma utilizando λ recombinación Red 3, se describen en detalle en la ref. 1.
    2. Verifique que todas las modificaciones de la secuencia.
    3. Transformar un plásmido que codifica una proteasa específica para la secuencia de reconocimiento utilizado anteriormente en una cepa que expresa el indicador fluorescente y proteína de interésen fusión traduccional. Se utilizó la proteasa UBP1, que escinde inmediatamente después de que el residuo C-terminal de ubiquitina 4.

    2. Las células de cultivo y preparar la Muestra

    1. Elija una E. colonia coli de interés a partir de una placa de agar recién rayada en 1 ml mínimo M9 suplementado con 5 medios 1X MEM aminoácidos ácidos y los antibióticos apropiados. Incubar en un agitador a temperatura deseada lo suficientemente largo para llegar a OD 600> 1,0 (densidad óptica a 600 nm).
    2. Se diluye la cultura en 1 ml de medio fresco M9 con los antibióticos apropiados a OD 600 = 0,02. Incubar en un agitador a temperatura apropiada. Densidad celular inicial se puede aumentar si es necesario para el crecimiento a baja temperatura.
    3. Cuando la DO 600 = 0,2-0,3 (a 37 ° C con un cultivo de células inicial a una DO 600 = 0,02, esto llevará hr 3-4), comenzar a preparar el gel de agarosa almohadilla (paso 3).
    4. Las células están listas para la formación de imágenes cuando OD
    5. Se transfiere 1 ml de cultivo se incubaron en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, centrifugar a 10.000 xg durante 1 min en una microcentrífuga de sobremesa.
    6. Desechar el sobrenadante y añadir 1 ml de medio fresco M9 y resuspender el pellet suavemente.
    7. Centrifugar a 10.000 xg durante 1 min.
    8. Repita los pasos 1,6 y 1,7. Eliminar el sobrenadante.
    9. Suavemente resuspender en 1 ml de medio M9. Las células se pueden usar directamente para imágenes de microscopio o diluida 10 - a 100-veces para asegurar bajas densidades celulares para formación de imágenes timelapse. Tenga en cuenta que las bajas densidades celulares son importantes para la formación de imágenes timelapse extendida. La cámara de formación de imágenes (paso 4) se sella durante el experimento. Debido al crecimiento exponencial de las células, las altas concentraciones de células iniciales puede reducir significativamente el oxígeno dentro de la cámara después de un crecimiento prolongado en la almohadilla de gel, reduciendo la maduración de la proteína fluorescente y afectando el crecimiento celular.

    3. Preparar la solución de agarosa

    1. Pesar 10-20 mgbaja temperatura de fusión de agarosa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Añadir un volumen apropiado medio mínimo M9 sin antibióticos para hacer una solución al 3% de agarosa.
    3. Se calienta la solución de agarosa durante 30 min a 70 º C para fundir, invirtiendo el tubo para asegurar que la solución está completamente fundida y homogénea. La almohadilla de gel se puede verter en este punto (paso 4) o la temperatura puede disminuirse a 50 ° C y se mantuvo durante varias horas para su uso posterior.

    4. Preparar Pad Gel en la Cámara

    1. Cerca de 50 minutos antes de la proyección de imagen, una diapositiva Microaqueduct enjuague con agua.
    2. Enjuagarse limpiar vidrio de cubierta (usando un método de limpieza rigurosas tal como el descrito en 6) y Microaqueduct portaobjetos con agua estéril y se seca por soplado con aire comprimido.
    3. Coloque la junta de goma en la diapositiva Microaqueduct de modo que cubra las entradas y salidas en el lado del cristal de la corredera Microaqueduct (esto se puede modificar para aplicaciones enmedios de comunicación que se perfunde a través de la muestra). Aplicar 50 l solución de agarosa (paso 3) para el centro de la diapositiva Microaqueduct.
    4. Arriba la solución de agarosa con el limpiado, vidrio de cubierta seca.
    5. Dejar que la solución de agarosa en reposo a temperatura ambiente durante 30 min.
    6. Mientras tanto, preparar una muestra de células (paso 2).
    7. Despegue cuidadosamente el vidrio de cubierta de la parte superior de la almohadilla de gel. Añadir 1,0 l cultivo de células lavadas a la parte superior de la almohadilla de gel. Esperar a ~ 2 min para el cultivo a ser absorbido por la almohadilla de gel. Es importante no esperar tanto tiempo que los overdries almohadilla de gel, pero lo suficientemente largo que las células están correctamente adherida a la almohadilla de gel. El tiempo de espera Ideal variará con la temperatura y la humedad.
    8. Mientras espera, secar otra cubierta de vidrio lavadas.
    9. Cubrir la muestra con la cubierta de vidrio nuevo asegurándose de que la cubierta de vidrio deslizante y Microaqueduct están bien alineados.
    10. Montar la cámara de temperatura controlada crecimiento siguiendo las instrucciones del fabricante.Se puede utilizar ahora para formación de imágenes en microscopio (paso 5).

    5. Imagen y Adquisición de Películas Timelapse

    1. Encender el láser y microscopio siguiendo las instrucciones del fabricante (por ejemplo, el láser puede ser necesario calentar durante ~ 0,5 h antes del experimento).
    2. Bloqueo de la cámara montada en el inserto de etapa en el microscopio. Establecer la temperatura de la cámara de crecimiento y el calentador objetivo a 37 º C o de otra temperatura deseada crecimiento.
    3. Si obtención de imágenes por encima de la temperatura ambiente, el enfoque o la almohadilla de gel normalmente se reduciría significativamente durante ~ 15 min después del cambio de temperatura inicial. En la práctica, utilizar este tiempo para encontrar las regiones de interés y modificar los scripts de imagen según sea necesario para un experimento.
    4. Encontrar las células en el microscopio y almacenar la posición de cada célula después de centrado dentro de una región de formación de imágenes predefinida y alineado. Más de una celda puede ser reflejada en cada ventana de tiempo de adquisición de imagen. Para timelapse imágenes sobre mlas generaciones, asegurar que las células con imagen son inicialmente separadas de otras células por lo menos unos pocos cientos de micras de modo que otras colonias no entrará en la región de formación de imágenes durante el crecimiento.
    5. Ajuste de la intensidad del láser de excitación para que casi todas las moléculas fotoblanqueador fluorescente dentro de 6 exposiciones (Figura 5).
    6. Utilización de un script automatizado de imágenes / revista, adquirir datos timelapse utilizando el algoritmo descrito en el flujo de trabajo experimental en la figura 3.

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    Representative Results

    Los resultados típicos de un experimento de COTRAC seguimiento de la producción de la CI λ represor se muestran en las Figuras 4 y 5. En este experimento, 12 colonias fueron imágenes a intervalos de 5 min. En cada punto de tiempo, la colonia se autofocused primera y centralizada dentro de la región de formación de imágenes. A continuación, la posición centrada / focalizada y se almacenó una imagen de campo claro fue adquirida. La etapa se transloca luego por ~ 0,5 micras a lo largo del eje z para moverse desde el plano focal campo claro para el plano bisector de las células (sin contraste de fases o contraste de interferencia diferencial (DIC) óptica, objetos semitransparentes se pueden obtener imágenes a ligeramente fuera de foco planos 8). Finalmente, seis imágenes fueron adquiridas a intervalos de 1 segundo, cada uno con una exposición de 100 ms (Figura 5 muestra un punto de tiempo tal). Esto se repitió para todas las células en cada punto de tiempo. Debido a que casi todas las moléculas de Venus La photobleached en cada punto de tiempo, los fluorescentesmanchas ciento en las figuras 4 y 5 corresponden a moléculas de Venus que maduraron (llegó a ser fluorescente) en los últimos 5 min. Moléculas de Venus madurar rápidamente in vivo con una vida media de 2-7 min ~ 1, 2, 7 y la escisión por la UBP1 es muy eficiente 4, 9. Por lo tanto, el número de moléculas de proteínas producidas desde la última medición se puede deducir con precisión a partir del número de moléculas de Venus contados sobre la membrana.

    Figura 1
    Figura 1. Uso de COTRAC para contar la expresión de moléculas individuales de factor de transcripción. (1) Un reportero incluyendo la secuencia membrana Tsr-localización, la Venus de maduración rápida YFP, y ubiquitina (Ub) se expresa en fusión traduccional con un factor de transcripción de un promoer regulado por el factor de transcripción. (2) La proteasa UBP1 co-traduccionalmente escinde el polipéptido naciente después el residuo C-terminal de Ub. (3) El reportero TSR-Venus-Ub se localiza en la membrana donde se puede contar en el único -molécula de nivel. (4) El factor de transcripción puede regular su propia expresión. Método de dibujos animados.

    Figura 2
    Figura 2. Las células esquemáticos de la cámara de la muestra utilizada en los experimentos COTRAC. Se colocan entre almohadilla de gel de agarosa y cubierta de vidrio. Microaqueduct diapositiva y objetiva se mantienen a una temperatura fija utilizando un controlador electrónico. Preparación de la muestra.

    Figura 3
    Figura 3. Flujo de trabajo de un típico experimento COTRAC. Experiflujo de trabajo mental.

    Figura 4
    Figura 4. Los datos típicos de un experimento de timelapse COTRAC. Imágenes de una sola colonia se muestran a intervalos de 25 min. En este experimento, los datos fueron adquiridos cada 5 min de 12 colonias diferentes. (A) Imágenes campo claro. (B) Venus (YFP) Imagen de fluorescencia (media de fondo restado para tener en cuenta el cambio en el fondo del campo de la imagen completa en el tiempo). (C ) Superposición imagen muestra la localización polo de moléculas indicadoras Tsr-Venus-Ub y la heterogeneidad en el número de moléculas producidas en 5 min ventanas de tiempo en las diferentes células (imagen de campo claro se invierte y la imagen de Venus es de paso de banda filtrada). Click here para ampliar la figura.

    Figura 5
    Figura 5. Los datos típicos de un solo punto de tiempo en un experimento COTRAC. (A) Venus (YFP) imágenes de fluorescencia. Seis 100 mseg exposiciones fueron adquiridos al comienzo de cada intervalo de 5 min tiempo. Cada una de las 6 exposiciones se separó por 900 mseg para dar tiempo a moléculas de Venus transitoriamente oscuras que había destellado a ser fluorescente. (B) Para el análisis, la imagen 6 se resta de la imagen 1 para corregir las moléculas de crudos y autofluorescencia de fondo. Manchas en esta imagen están localizados en linajes celulares específicos y cuantificados por su intensidad de fluorescencia integrada. (C) La media de fluorescencia integrada de la colonia en A se representa más de 6 imágenes (por lolínea de tapa). Montaje de esta línea a un decaimiento exponencial más un desplazamiento constante (línea discontinua) da un decaimiento de medio tiempo de 1 seg. En este experimento, Venus fotoblanqueador moléculas mucho más rápidamente que la autofluorescencia celular, por lo que esto significa que aproximadamente la mitad del número total de moléculas de Venus La photobleached en cada trama. Photobleaching progreso en un solo punto de tiempo.

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    Discussion

    El método COTRAC puede ser generalizado para medir la producción de otras proteínas en la que N-o C-terminales convencionales fusiones de proteínas fluorescentes pueden perturbar la actividad de proteína. La estrategia COTRAC tiene tres ventajas únicas sobre los métodos actuales. En primer lugar, co-traduccional de fusión asegura que una molécula del indicador fluorescente es producida por cada molécula de la proteína de interés, lo que permite un recuento preciso de la producción de proteínas en tiempo real. En segundo lugar, el reportero membrana orientada TSR-Venus permite una sola molécula de detección de reporteros fluorescentes, lo que permite la detección de proteínas expresadas en niveles muy bajos. En tercer lugar y lo más importante, la escisión co-traduccional del reportero fluorescente permite que la proteína de interés para retener su casi secuencia de tipo silvestre y la función normalmente utilizando ubiquitina como una secuencia de reconocimiento de la proteasa en E. coli, proteínas diana sólo difieren de sus secuencias de péptidos de tipo salvaje en que la primera N-terminal N </ Em>-formil-metionina se cambia a metionina.

    Cuando se utiliza el método COTRAC, es importante tener en cuenta que el método COTRAC mide el número de moléculas de proteínas producidas en cada ventana de tiempo de 5-min, que es distinta de la medida del número de moléculas de proteína presentes por célula (es decir, la de concentración de proteína). La mayoría de una sola célula de la expresión génica ensayos de fluorescencia medida de la concentración de proteína, que es el resultado equilibrado de la producción de proteínas y la degradación. Por lo tanto, la tasa de degradación de la proteína de interés se debe considerar cuidadosamente si la medición de la concentración se usa para deducir la información de producción de proteínas. Además, la concentración de proteína está sujeta a fluctuaciones causadas por la partición de la proteína entre dos células hijas en la división celular, que pueden ser importantes para las proteínas de bajo nivel de la expresión y erróneamente interpretado como el resultado de la dinámica de producción de proteínas. El método COTRAC pueden modificarsecado para medir la concentración de proteínas por no photobleaching nueva producción moléculas indicadoras, pero esto debe hacerse con control extra. Se debe verificar que las tasas de degradación de la informadora fluorescente y la proteína de interés son similares, y que ambos están igualmente dividida en dos células hijas en la división celular, de modo que la concentración del indicador fluorescente refleja la de la proteína de interés.

    Observamos que mientras que el COTRAC no altera la secuencia de la proteína, la adición del gen indicador cambia la secuencia de ARNm. Por lo tanto, la transcripción y la traducción dinámica y / o las tasas de transcripción de ARNm de degradación puede ser perturbado. Si el método COTRAC se utiliza para observar la producción de proteínas en el contexto de tipo salvaje, es importante comparar los niveles de expresión de la proteína diana, tanto en su secuencia de tipo salvaje y con la etiqueta de fusión COTRAC fluorescente (por ejemplo en la ref. 1 se comparó CI expresión en nuestro COTRAC construcciónt hasta que en un lisógeno tipo salvaje). A continuación se discuten las consideraciones necesarias para generalizar el método COTRAC.

    En primer lugar, se discute la posibilidad de utilizar otras secuencias de Tsr-Venus-Ub. Los requisitos generales son: (1) el informador debe estar localizada en alguna posición dentro de la célula de manera que no se difunde rápidamente (con Tsr, reporteros están en los polos de la célula 1). Esto es necesario para la detección de moléculas individuales de una molécula de proteína fluorescente como la señal de una molécula de proteína rápidamente difusora fluorescente no suele ser detectable por encima del fondo autofluorescente de una célula, (2), la proteína fluorescente debe ser suficientemente brillante como para ser detectada en la nivel de una sola molécula y debe madurar (vuelven fluorescentes) con la suficiente rapidez para la aplicación deseada (Venus es la proteína más rápido de maduración fluorescente hasta la fecha 7), (3), la proteína fluorescente debe ser photobleached después de la detección de manera que las nuevas proteínas fluorescentes se pueden deprotegidos en puntos de tiempo posteriores (proteínas fluorescentes que son demasiado resistente al fotoblanqueo son indeseables como la exposición al láser excesiva puede causar artefactos de fototoxicidad), (4), la secuencia de reconocimiento de la proteasa no puede salir de cualquiera de los aminoácidos residuales en la proteína de interés que va a perturbar su funcionalidad (UBP1 escinde inmediatamente después de que el residuo carboxi-terminal Ub, sin dejar residuos extra en absoluto).

    En segundo lugar, hay que comprobar que el reportero está bien expresado y troceados. La escisión proteolítica que separa el reportero de la proteína de interés debe ser eficiente; eficacia de escisión se puede medir mediante Western blots contra el reportero, la proteína de interés o ambos-JL (anticuerpos están disponibles comercialmente para muchas proteínas fluorescentes tales como el anticuerpo anti-GFP 8 de Clontech, que se une a Venus en Western blot). Uno debe asegurarse de que ninguna proteína de fusión no escindida se detectó en transferencias contra los lisados ​​de las células que expresan la fusiónproteína en niveles superiores a los previstos en los experimentos COTRAC. Además, el reportero y proteína de interés debe ser producido en una proporción de 1:1 después de la escisión. Esto se puede comprobar mediante la medición de las intensidades de las bandas de troceados en anti-reportero y anti-proteína de intereses transferencias Western normalizados por las intensidades de las bandas uncleaved en cepas que carecen de proteasa. Si reportero y proteína de interés están presentes en una proporción de 1:1 después de la escisión, a continuación:

    Tenga en cuenta que, dado que la concentración de proteínas Western blots medida, la relación resultante se desviará de 1:1 si el informador y la proteína de interés presentan diferentes tasas de degradación después de la escisión.

    En tercer lugar, se debe comprobar que la proteína de interés exhibe su funcionalidad esperada después de la escisión. La presencia del reportero gran constructo de fusión y / o localización de la membrana celular se espera que la mayoría de inactivar los factores de transcripción (la λ represor CI fue completely inactivo sin UBP1 expresión en nuestros experimentos 1). Transformación del plásmido que expresa la proteasa debe activar la proteína de interés por la liberación de la proteína a partir de la etiqueta de fusión traduccional voluminoso. Este fenómeno da lugar a otras aplicaciones COTRAC posibles. La escisión en el extremo carboxi Ub por UBP1 se ha utilizado para exponer no canónicos amino-terminal de aminoácidos para dilucidar el bacteriana regla del N final de la degradación de proteínas 9. Si la fusión de un gran, asociada a la membrana reportero inactiva un factor de transcripción (u otra proteína tal como una enzima), su actividad puede ser rápidamente recuperada por que induce la expresión de proteasa. COTRAC podría ser utilizado para muy rápidamente "activar" un conjunto preexistente de factores de transcripción mediante la eliminación / adición de un inhibidor / co-activador o de lo contrario iniciar la expresión o actividad de la proteasa. Por último, la expresión del reportero fluorescente puede perturbar la fisiología celular y debe garantizarse que las propiedades tales como célulastiempo de ciclo no se ven afectadas, en el experimento descrito en la ref. 1, se utilizó la proteína Tsr como una secuencia de localización de membrana porque Tsr ya es una proteína de membrana altamente expresado y un pequeño aumento en la expresión de Tsr no se espera que afecte el comportamiento celular.

    En cuarto lugar, cuando una secuencia informadora que no sea el discutido específicamente TSR-Venus-Ub se utiliza, el protocolo de formación de imágenes correspondiente también debe ser modificado según sea necesario. Por ejemplo, diferentes proteínas fluorescentes se requieren protocolos diferentes de iluminación para lograr un buen equilibrio entre eficientemente la detección de moléculas de proteínas fluorescentes, la fototoxicidad de la exposición al láser y fotoblanqueo. Idealmente, una excitación láser debe estar en el pico de absorbancia de la proteína fluorescente elegido; fuera de pico de excitación requiere mayores intensidades de excitación (y por lo tanto mayor fototoxicidad y autofluorescencia de fondo) para lograr la misma emisión proteína fluorescente y características de fotoblanqueo. Además, lafrecuencia de formación de imágenes puede ser modificada para ser más lento o más rápido que 5 min dependiendo de la tolerancia de las células a la fototoxicidad de la exposición al láser. En nuestros experimentos, 12 separado E. colonias de E. coli se obtuvieron imágenes de cada 5 minutos y seguido de 7-8 ciclos celulares antes de observar defectos sustanciales fototoxicidad 1.

    Finalmente, después de películas a intervalos de producción de proteína se adquieren en un experimento COTRAC (ejemplos mostrados en las Figuras 4 y 5), expresión de la proteína fluorescente necesita ser cuantificado mediante la detección de manchas fluorescentes correspondientes a una o más moléculas, la asignación de moléculas a las células individuales y el seguimiento de los linajes celulares. Hemos descrito una rutina personalizada Matlab para estudiar la producción λ represor CI 1. En pocas palabras, primero hay que identificar los contornos de las células individuales y puntos temporales correspondientes a la división celular en las imágenes de campo claro, mientras que el seguimiento de linajes celulares a través de cuadro de imagen posteriors. Se encontró que un intervalo de tiempo de 5 minutos fue lo suficientemente corto que una celda en una trama por lo general corresponde a la celda de la trama anterior con la que compartía la mayoría de los píxeles en una imagen segmentada. En los casos en que grandes cambios ocasionales de colonias entre dos fotogramas subsiguientes fueron observadas, asignación manual de células individuales para sus linajes se requería. A continuación, es necesario identificar los puntos fluorescentes y cuantificar su intensidad. Hemos encontrado que puntos fluorescentes podrían ser identificados por (1) de paso de banda filtrado de la imagen de fluorescencia para eliminar de baja frecuencia de fluorescencia de fondo (por ejemplo autofluorescencia) y el ruido de alta frecuencia, (2) umbral de la imagen en función de la intensidad de fluorescencia y (3) la identificación de objetos más grande que unos pocos píxeles de la imagen thresholded. Los objetos de la imagen thresholded se ajustaron a una función 2-dimensional Gaussian más una constante de fondo, y la intensidad integrada de la mancha fue tomada como el producto de la amplitud de ajuste y la varianza.En nuestros experimentos, múltiples Tsr-Venus-Ub reporteros a menudo co-localizados en los polos de la célula, creando puntos que eran más brillantes que las de un solo TSR-Venus moléculas. El número de moléculas de Venus dentro de un punto se cuantificó mediante la división de la intensidad integrada de la mancha por la intensidad de fluorescencia de una sola molécula de Venus, que se cuantificó mediante el uso de un bajo nivel de expresión cepa en la que los puntos raramente contienen más de una proteína fluorescente molécula. Esta medición puede completarse además con mediciones in vitro de moléculas individuales de proteínas fluorescentes se adhirieron a un portaobjetos de vidrio. Hemos encontrado que las propiedades fluorescentes de proteínas son muy similares en in vivo y en sistemas in vitro con condiciones de tampón similares.

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    Disclosures

    No tenemos revelaciones.

    Acknowledgements

    El plásmido que expresa pCG001 UBP1 fue proporcionado amablemente por Rohan Baker en la Escuela John Curtin de Investigación Médica. Este trabajo fue financiado por March of Dimes Beca de Investigación 1-el año fiscal 2011, March of Dimes Premio Basil O'Connor Starter Académico de Investigación # 5-FY20 y adjudicación NSF CARRERA 0.746.796.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Agarose (Low melting temperature) Lonza 50100
    Milli-Q H2O
    5×M9 salts Following recipe described in 9
    20% glucose
    MgSO4
    CaCl2
    50×MEM amino acid solution Invitrogen 11130-051
    Temperature-Controlled Growth Chamber
    Stage adaptor
    Bioptechs FCS-2
    Objective Heater Bioptechs Model depends on microscope objective
    Microaqueduct Slide Bioptechs 130119-5
    Micro cover glasses VWR 40CIR-1 Can be difficult to source; also available from Bioptechs
    Cover glass/slide gasket Bioptechs FCS2 0.75 mm
    Fluorescence Microscope Various Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins
    EM-CCD Camera Various Example setup: Andor Ixon DU-898 Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background

    References

    1. Hensel, Z., Feng, H.D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., & Xiao, J. Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis. Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).
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