Name: winogradsky column microbial layers and gradients
Uploaded: 2023-04-30T07:09:27.000Z
Duration: 8 min 8 s
Channel: JoVE

1. الإعداد
<ol>
	<li>لإعداد عمود Winogradsky ، ستحتاج إلى بعض المستلزمات الأساسية:
	<ul>
		<li>مجرفة ودلو وزجاجة لجمع العينات في الميدان</li>
		<li>وعاء عمودي شفاف ، مثل أسطوانة متدرجة أو زجاجة ماء بلاستيكية تزن حوالي 1 لتر </li>
		<li>غلاف بلاستيكي وأربطة مطاطية</li>
		<li>أوعية خلط كبيرة وملعقة كبيرة للتقليب</li>
		<li>مصدر الكبريت (صفار البيض أو كبريتات الكالسيوم)</li>
		<li>مصدر للكربون العضوي (السليلوز ، على شكل جريدة ممزقة) </li>
		<li>مصدر للضوء (نافذة مشمسة أو مصباح مكتبي)</li>
		<li>التربة أو الطين الذي تم جمعه من مستنقع أو أرض رطبة أو بركة أو مجرى مائي </li>
		<li>المياه من نفس الموطن </li>
		<li>اختياري سيكون ما يلي ضروريا لبعض التجارب الاختيارية الموضحة في هذا البروتوكول:
		<ul>
			<li>ملح طعام</li>
			<li>السيلوفان الملون بشكل مختلف</li>
			<li>مصدر للحديد (مثل مسمار أو صوف فولاذي)</li>
			<li>ثلاجة بمصدر ضوء</li>
			<li>مبرد بالقرب من مصدر ضوء</li>
		</ul>
		</li>
	</ul>
	</li>
	<li>إذا كنت تستخدم زجاجة ماء بلاستيكية ، فقم بقطع منطقة الرقبة بحيث يكون العمود أسطوانيا. قم بإزالة أي أغلفة حتى يتغلغل الضوء عبر البلاستيك. </li>
	<li>قد يحتوي البيض النيء على السالمونيلا ويجب التعامل معها بحذر. يجب اتباع تقنيات غسل اليدين المناسبة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام البيض المسلوق. بالإضافة إلى ذلك ، لا توجد طريقة لمعرفة ما إذا كان الطين أو الرواسب ملوثا بمياه الصرف الصحي أو غيرها من المواد الضارة. يجب استخدام القفازات عند خلط الطين وإعداد العمود. </li>
</ol>
2. تجميع عمود فينوغرادسكي
<ol>
	<li>باستخدام المجرفة ، احفر الطين واجمعه في الدلو. يجب أن تكون الرواسب بالقرب من حافة الماء ومشبعة تماما بالماء. ستحتاج إلى ما يكفي من الطين لملء كل عمود من أعمدة فينوغرادسكي. اجمع بعض الماء من نفس المصدر في زجاجة العينة (هناك حاجة إلى حوالي 3000 مل لكل عمود). </li>
	<li>في المختبر ، انقل كمية كافية من الطين إلى وعاء الخلط الأول لملء ~ 75٪ من عمود الحجم سعة 1 لتر. بعد ذلك ، قم بالغربلة لإزالة الصخور الكبيرة أو الأغصان أو الأوراق أثناء استخدام الملعقة لتفتيت الكتل. </li>
	<li>أضف بعض الماء الذي جمعته إلى وعاء الخلط أثناء التحريك. أضف حتى يصبح قوام خليط الماء والطين مثل اللبن المخفوق. استمر في التأكد من عدم وجود كتل. </li>
	<li>انقل حوالي 1/3 من اللبن المخفوق المائي إلى الوعاء الثاني. نضيف صفار البيض وحفنة من الجرائد المبشورة ونخلط. </li>
	<li>أضف خليط الطين وصفار البيض والجرائد إلى العمود حتى يمتلئ العمود بحوالي 1/4. </li>
	<li>أضف خليط الماء والطين العادي إلى العمود حتى يمتلئ العمود بحوالي 3/4. </li>
	<li>أضف الماء الإضافي إلى العمود ، ولم يتبق سوى مساحة صغيرة (~ 1/2 بوصة) من الهواء في الأعلى. </li>
	<li>قم بتغطية العمود بغلاف بلاستيكي وقم بتثبيته بشريط مطاطي. </li>
	<li>احتضان العمود في الضوء في درجة حرارة الغرفة. </li>
	<li>خلال الأسابيع الأربعة إلى الثمانية القادمة ، راقب التغييرات في عمود فينوغرادسكي لتطوير طبقات ملونة مختلفة وتكوين فقاعات ، كما هو موضح في الجدول 1. بالإضافة إلى ذلك ، يجب عليك تسجيل الوقت الذي يستغرقه تطوير طبقات مختلفة. </li>
</ol>
3. تعديلات اختيارية على عمود فينوغرادسكي الكلاسيكي 
<ol>
	<li>أضف 25-50 جم من الملح لكل عمود فينوغرادسكي سعة 1 لتر إلى الطين الذي تم جمعه قبل إضافة الماء والتقليب (الخطوة 2.3). إضافة الملح يختار البكتيريا المحبة للملح (المحبة للملح). </li>
	<li>يمكن إضافة ركائز بديلة ، مثل الحديد ، على شكل مسمار أو صوف فولاذي ، إلى العمود جنبا إلى جنب مع صفار البيض والجريدة المقطعة (الخطوة 2.4). سيؤدي ذلك إلى إثراء البكتيريا المؤكسدة للحديد ، مثل Gallionella ، وستظهر كطبقة بلون الصدأ. </li>
	<li>بدلا من درجة حرارة الغرفة (الخطوة 2.9) ، يمكن تحضين العمود بالقرب من المبرد لاختيار البكتيريا المحبة للحرارة (المحبة للحرارة) أو في الثلاجة ذات مصدر الضوء لاختيار البكتيريا المحبة للنفسية (المحبة للبرد). </li>
	<li>يمكن أيضا تغيير كمية الضوء التي يتلقاها العمود أثناء احتضانه (الخطوة 2.9) عن طريق وضع أعمدة مختلفة في الإضاءة العالية أو الإضاءة المنخفضة أو الظلام. </li>
	<li>يمكن الحد من الطول الموجي للضوء الوارد من خلال تغطية العمود بالسيلوفانات المظللة بشكل مختلف أثناء احتضانه (الخطوة 2.9) لتحديد الألوان التي تختارها لمجموعات بكتيرية مختلفة. </li>
</ol>
4. تحليل البيانات
<ol>
	<li>بعد 1-3 أسابيع ، يجب أن يكون بعض الألوان الخضراء على الجزء العلوي من الطبقة الطينية لعمود فينوغرادسكي الكلاسيكي مرئيا (الشكل 2 أ). هذه هي العلامات الأولى لنمو طبقة البكتيريا الزرقاء. </li>
	<li>بمرور الوقت ، استمر في مراقبة مظهر وتطور الطبقات المختلفة ، كل منها يشير إلى أنواع البكتيريا المختلفة. تلميح: راجع المفاهيم والجدول 1 لفهم البكتيريا التي تساهم في الطبقات المختلفة. </li>
</ol>
<img alt="Figure 2A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10506/10506fig2a.jpg"> 
الشكل 2 أ: صورة لعمود فينوغرادسكي كلاسيكي تم احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 21 يوما. لاحظ الرواسب الخضراء ، التي تدل على البكتيريا الزرقاء ، في الجزء العلوي من العمود. 
<ol start="3">
	<li>إذا تم أيضا إعداد تعديلات على عمود فينوغرادسكي الكلاسيكي ، قارن نتائج كل عمود.
	<ol>
		<li>راقب الطبقات في كل عمود من أعمدة فينوغرادسكي المعدلة. لاحظ ما يلي:
		<ul>
			<li>هل تعرض الأعمدة نفس عدد الطبقات؟ </li>
			<li>هل الطبقات بنفس اللون والسماكة؟ </li>
			<li>هل توجد الطبقات في نفس الأعماق؟ </li>
			<li>كم من الوقت استغرق كل عمود للتطوير؟ </li>
			<li>هل تطور أحد الأعمدة بشكل أبطأ من الآخرين؟ </li>
		</ul>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

عمود Winogradsky هو مثال على نظام بيئي ميكروبي مترابط. بعد خلط الطين والماء وركائز الكربون والكبريت الإضافية في عمود رأسي ، يجب أن يستقر النظام البيئي الطبقي في مناطق منفصلة ومستقرة على مدى عدة أسابيع. تشغل هذه المناطق الكائنات الحية الدقيقة المختلفة التي تزدهر في بقعة معينة على طول التدرج بين الرواسب الغنية بالكبريتيد في الأسفل والرواسب الغنية بالأكسجين في الأعلى. من خلال التلاعب بالظروف والركائز داخل عمود وينوغرادسكي ، يمكن ملاحظة وجود ونشاط الكائنات الحية الدقيقة المختلفة مثل محبي الهالوفيل ، ومحبي الحرارة ، ومحبي الن...

إنشاء عمود فينوغرادسكي: طريقة لإثراء الأنواع الميكروبية في عينة الرواسب

Creating a Winogradsky Column: A Method to Enrich the Microbial Species in a Sediment Sample

p class = "jove_content" &gt;المصدر: إليزابيث سوتر1 ، كريستوفر كوربو1 ، جوناثان بليز1 
1 قسم العلوم البيولوجية ، كلية فاغنر ، 1 طريق الحرم الجامعي ، جزيرة ستاتن نيويورك ، 10301
 عمود Winogradsky هو نظام بيئي مصغر مغلق يستخدم لإثراء المجتمعات الميكروبية للرواسب ، وخاصة تلك المشاركة في دورة الكبريت. تم استخدام العمود لأول مرة من قبل سيرجي فينوغرادسكي في ثمانينيات القرن التاسع عشر ، ومنذ ذلك الحين تم تطبيقه في دراسة العديد من الكائنات الحية الدقيقة المتنوعة المشاركة في الكيمياء الجيولوجية الحيوية ، مثل أجهزة التمثيل الضوئي ، ومؤكسدات الكبريت ، ومخفضات الكبريتات ، والميثانوجينات ، ومؤكسدات الحديد ، ودورات النيتروجين ، وأكثر من ذلك (1،2).
تعتبر غالبية الكائنات الحية الدقيقة على الأرض غير قابلة للزراعة ، مما يعني أنه لا يمكن عزلها في أنبوب اختبار أو على طبق بتري (3). ويرجع ذلك إلى العديد من العوامل ، بما في ذلك أن الكائنات الحية الدقيقة تعتمد على الآخرين لبعض المنتجات الأيضية. تحاكي الظروف الموجودة في عمود فينوغرادسكي عن كثب الموائل الطبيعية للكائنات الحية الدقيقة ، بما في ذلك تفاعلاتها مع الكائنات الحية الأخرى ، وتسمح بزراعتها في المختبر. لذلك ، تسمح هذه التقنية للعلماء بدراسة هذه الكائنات الحية وفهم مدى أهميتها للدورات البيوجيوكيميائية للأرض دون الحاجة إلى زراعتها بمعزل عن غيرها.
 تمتلئ بيئات الأرض بالكائنات الحية الدقيقة التي تزدهر في جميع أنواع الموائل ، مثل التربة ومياه المحيطات والسحب والرواسب في أعماق البحار. في جميع الموائل ، تعتمد الكائنات الحية الدقيقة على بعضها البعض. مع نمو الكائنات الحية الدقيقة ، فإنها تستهلك ركائز معينة ، بما في ذلك الوقود الغني بالكربون مثل السكريات وكذلك العناصر الغذائية والفيتامينات وغازات الجهاز التنفسي مثل الأكسجين. عندما تنفد هذه الموارد المهمة ، يمكن للكائنات الحية الدقيقة المختلفة ذات الاحتياجات الأيضية المختلفة أن تزدهر وتزدهر. على سبيل المثال ، في عمود فينوغرادسكي ، تستهلك الميكروبات أولا المادة العضوية المضافة بينما تستنفد الأكسجين في الطبقات السفلية من العمود. بمجرد استخدام الأكسجين ، يمكن للكائنات اللاهوائية أن تتولى المواد العضوية المختلفة وتستهلكها. يسمى هذا التطور المتتالي للمجتمعات الميكروبية المختلفة بمرور الوقت بالخلافة (4). التعاقب الميكروبي مهم في عمود فينوغرادسكي ، حيث يغير النشاط الميكروبي كيمياء الرواسب ، مما يؤثر بعد ذلك على نشاط الميكروبات الأخرى وما إلى ذلك. تعيش العديد من الكائنات الحية الدقيقة في التربة والرواسب أيضا على طول التدرجات ، وهي مناطق انتقالية بين نوعين مختلفين من الموائل بناء على تركيزات الركائز (5). في المكان الصحيح في التدرج ، يمكن للميكروب أن يتلقى الكميات المثلى من الركائز المختلفة. مع تطور عمود فينوغرادسكي ، يبدأ في تقليد هذه التدرجات الطبيعية ، لا سيما في الأكسجين والكبريتيد (الشكل 1).
<img alt="الشكل 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10506/10506fig1.jpg"> 
الشكل 1: تمثيل لتدرجات الأكسجين (O2) والكبريتيد (H2S) التي تتطور في عمود فينوغرادسكي.
في عمود فينوغرادسكي ، يتم خلط الطين والماء من البركة أو الأراضي الرطبة في عمود شفاف ويسمح لهم بالتحتضن ، عادة في الضوء. تتم إضافة ركائز إضافية إلى العمود لإعطاء مصادر الكربون للمجتمع ، عادة على شكل السليلوز والكبريت. عادة ما تبدأ أجهزة التوليف الضوئية في النمو في الطبقات العليا من الرواسب. تتكون هذه الكائنات الحية الدقيقة الضوئية إلى حد كبير من البكتيريا الزرقاء ، التي تنتج الأكسجين وتظهر كطبقة خضراء أو حمراء بنية (الشكل 2 ، الجدول 1). بينما ينتج التمثيل الضوئي الأكسجين ، فإن الأكسجين غير قابل للذوبان في الماء وينخفض تحت هذه الطبقة (الشكل 1). هذا يخلق تدرجا للأكسجين ، يتراوح من تركيزات عالية من الأكسجين في الطبقات العليا إلى صفر أكسجين في الطبقات السفلية. تسمى الطبقة المؤكسجة بالطبقة الهوائية والطبقة الخالية من الأكسجين تسمى الطبقة اللاهوائية.
 في الطبقة اللاهوائية ، يمكن أن تتكاثر العديد من المجتمعات الميكروبية المختلفة اعتمادا على نوع وكمية الركائز المتاحة ، ومصدر الميكروبات الأولية ، ومسامية الرواسب. في الجزء السفلي من العمود ، يمكن للكائنات الحية التي تكسر المواد العضوية بشكل لاهوائي أن تزدهر. ينتج التخمير الميكروبي أحماض عضوية من انهيار السليلوز. يمكن بعد ذلك استخدام هذه الأحماض العضوية بواسطة مخفضات الكبريتات ، والتي تؤكسد تلك المواد العضوية باستخدام الكبريتات ، وتنتج الكبريتيد كمنتج ثانوي. يشار إلى نشاط مخفضات الكبريتات إذا تحولت الرواسب إلى اللون الأسود ، لأن الحديد والكبريتيد يتفاعلان لتكوين معادن كبريتيد الحديد الأسود (الشكل 2 ، الجدول 1). ينتشر الكبريتيد أيضا لأعلى ، مما يخلق تدرجا آخر تكون فيه تركيزات الكبريتيد عالية في الجزء السفلي من العمود ومنخفضة في الجزء العلوي من العمود (الشكل 1).
بالقرب من منتصف العمود ، تستفيد مؤكسدات الكبريت من إمداد الأكسجين من الأعلى والكبريتيد من الأسفل. مع الكمية المناسبة من الضوء ، يمكن أن تتطور مؤكسدات الكبريت الضوئية في هذه الطبقات. تعرف هذه الكائنات الحية باسم بكتيريا الكبريت الخضراء والأرجوانية ، وغالبا ما تظهر على شكل خيوط وبقع خضراء أو أرجوانية أو أرجوانية حمراء (الشكل 2 ، الجدول 1). تتمتع بكتيريا الكبريت الأخضر بقدرة أعلى على تحمل الكبريتيد وعادة ما تتطور في الطبقة الموجودة أسفل بكتيريا الكبريت الأرجواني مباشرة. فوق بكتيريا الكبريت الأرجواني ، قد تتطور أيضا البكتيريا الأرجوانية غير الكبريتية. تقوم هذه الكائنات الحية بالتمثيل الضوئي باستخدام الأحماض العضوية كمتبرعين للإلكترون بدلا من الكبريتيد وغالبا ما تظهر كطبقة حمراء أو أرجوانية أو برتقالية أو بنية. يمكن أن تتطور مؤكسدات الكبريت غير الضوئية فوق البكتيريا الأرجوانية غير الكبريتية ، وعادة ما تظهر هذه على شكل خيوط بيضاء (الشكل 2 ، الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك ، قد تتشكل الفقاعات أيضا في عمود فينوجرادسكي. تشير الفقاعات الموجودة في الطبقات الهوائية إلى إنتاج الأكسجين بواسطة البكتيريا الزرقاء. من المحتمل أن تكون الفقاعات في الطبقات اللاهوائية ناتجة عن نشاط الميثانوجينات ، وهي كائنات حية تكسر المواد العضوية بشكل لاهوائي وتشكل الميثان كمنتج ثانوي.
<border fo: keep-together.within-page="1" keep-with-next.within-page="دائما">
	<tbody>
		<tr>
			<td>الموضع في العمود</td>
			<td>المجموعة الوظيفية</td>
			<td>أمثلة على الكائن الحي</td>
			<td>المؤشر المرئي</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>أعلى</td>
			<td>أجهزة التوليف الضوئي</td>
			<td>البكتيريا الزرقاء</td>
			<td>طبقة خضراء أو بنية محمرة. في بعض الأحيان فقاعات الأكسجين.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5"></td>
			<td>مؤكسدات الكبريت غير الضوئية</td>
			<td>بيجياتوا ، ثيوباسيليوس</td>
			<td>طبقة بيضاء.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>البكتيريا الأرجواني غير الكبريت</td>
			<td>رودوميكروبيوم ، رودوسبيريلوم ، رودوبسيودمانا</td>
			<td>طبقة حمراء أو أرجوانية أو برتقالية أو بنية.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>بكتيريا الكبريت الأرجواني</td>
			<td>الكروماتيوم</td>
			<td>طبقة أرجوانية أو أرجوانية حمراء.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>بكتيريا الكبريت الأخضر</td>
			<td>الكلوروبيوم</td>
			<td>طبقة خضراء.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>بكتيريا تقليل الكبريتات</td>
			<td>Desulfovibrio ، Desulfotomaculum ، Desulfobacter ، Desulfuromonas</td>
			<td>طبقة سوداء.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>قاع</td>
			<td>الميثانوجينات</td>
			<td>المكورات الميثانوكورية ، ميثانوسارسينا</td>
			<td>في بعض الأحيان فقاعات الميثان.</td>
		</tr>
	</tbody>

 الجدول 1: المجموعات الرئيسية للبكتيريا التي قد تظهر في عمود فينوغرادسكي الكلاسيكي ، من أعلى إلى أسفل. يتم إعطاء أمثلة على الكائنات الحية من كل مجموعة ، ويتم سرد المؤشرات المرئية لكل طبقة من الكائنات الحية. استنادا إلى Perry et al. (2002) و Rogan et al. (2005).</border>

في هذه التجربة ، تم جمع المياه والرواسب من موطن المياه العذبة. تم بناء عمودين من Winogradsky وسمح لهم بالتطور: عمود Winogradsky الكلاسيكي المحتضن في الضوء في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2 أ) وعمود Winogradsky المحتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2 ب). 
<img alt="Figure 2B" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10506/10506fig2b.jpg"> 
الشكل 2 ب: صورة لعمود فينوغرادسكي الكلاسيكي (على اليسار) ، محتضن في درجة حرارة الغرفة في الضوء لمدة 68 يوما وعمود فينوغرادسكي محتضن في...

Source: Elizabeth Suter1, Christopher Corbo1, Jonathan Blaize1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island NY, 
...

لا يمكن استزراع معظم الكائنات الحية الدقيقة على الأرض في المختبر ، غالبا لأنها تعتمد على ميكروبات أخرى داخل مجتمعاتها الأصلية. عمود فينوغرادسكي ، الذي سمي على اسم مخترعه سيرجي فينوغرادسكي ، هو نظام بيئي مصغر مغلق يثري المجتمعات الميكروبية داخل عينة الرواسب ، مما يمكن العلماء من دراسة العديد من الميكروبات التي تلعب دورا حيويا في العمليات البيوجيوكيميائية للأرض ، دون الحاجة إلى عزلها واستزراعها بشكل فردي. عادة ما يتم خلط الطين والماء من نظام بيئي ، مثل البركة أو المستنقعات. كتجربة اختيارية ، يمكن إضافة الملح إلى هذا الخليط لإثراء أنواع الهاليات المختلفة. بعد ذلك ، يتم استكمال جزء صغير من الخليط بالكربون ، عادة على شكل سليلوز من الجرائد ، والكبريت ، عادة من صفار البيض. لتجربة اختيارية أخرى ، يمكن إضافة مسمار إلى هذا الخليط لإثراء أنواع معينة من Gallionella. ثم يضاف هذا الخليط الجديد إلى عمود شفاف ، بحيث يكون العمود ممتلئا بالربع. أخيرا ، يضاف باقي خليط الطين والمزيد من الماء إلى العمود حتى يمتلئ معظم الطريق. يمكن ملاحظة الخلافة ، التي تشير إلى التطور المتتالي للمجتمعات الميكروبية المختلفة بمرور الوقت ، في الوقت الفعلي باستخدام عمود فينوغرادسكي. عندما تنمو الميكروبات داخل العمود ، فإنها تستهلك ركائز محددة وتغير كيمياء بيئتها. عندما تنضب ركائزها ، تموت الميكروبات الأصلية ويمكن أن تزدهر الميكروبات ذات الاحتياجات الأيضية المختلفة في البيئة المتغيرة. بمرور الوقت ، تبدأ طبقات متميزة بشكل واضح في التكون ، كل منها يحتوي على أجزاء من مجتمع بكتيري مع احتياجات بيئية دقيقة مختلفة. على سبيل المثال ، تشكل ميكروبات التمثيل الضوئي ، التي تتكون إلى حد كبير من البكتيريا الزرقاء ، طبقات خضراء أو حمراء بنية بالقرب من الجزء العلوي من العمود. نظرا لأن عملية التمثيل الضوئي تنتج الأكسجين ، وغالبا ما ينظر إليها على أنها فقاعات في الجزء العلوي من العمود ، يتم تشكيل تدرج بأعلى تركيزات الأكسجين بالقرب من الأعلى ، والأدنى باتجاه الأسفل. اعتمادا على الركائز المتاحة ، يمكن أن تنمو المجتمعات الميكروبية المختلفة في الطبقة السفلية اللاهوائية. يمكن أن تشير الفقاعات الموجودة في هذه الطبقة إلى وجود الميثانوجينات التي تخلق غاز الميثان عن طريق التخمير. هنا ، ينتج عن التخمير الميكروبي للسليلوز أحماض عضوية. تعمل مخفضات الكبريتات على أكسدة تلك الأحماض لإنتاج الكبريتيد ، ويشار إلى نشاطها بواسطة الرواسب السوداء. ينتشر الكبريتيد لأعلى في العمود ، مما يخلق تدرجا آخر حيث تكون تركيزات الكبريتيد أعلى باتجاه أسفل العمود ، والأدنى بالقرب من الأعلى. في منتصف العمود ، تستخدم مؤكسدات الكبريت الأكسجين من الأعلى والكبريتيد من الأسفل. مع الضوء الكافي ، تتطور مؤكسدات الكبريت الضوئية ، مثل بكتيريا الكبريت الخضراء والأرجوانية. تتحمل بكتيريا الكبريت الأخضر تركيزات أعلى من الكبريتيد. وبالتالي ، فإنها تنمو مباشرة تحت بكتيريا الكبريت الأرجواني. فوق هذه الطبقة مباشرة ، تشكل البكتيريا الأرجوانية غير الكبريتية طبقة حمراء برتقالية. يشار إلى مؤكسدات الكبريت غير الضوئية من خلال وجود خيوط بيضاء. يمكن أيضا أن تتنوع ظروف مثل الضوء ودرجة الحرارة لإثراء المجتمعات الأخرى. في هذا الفيديو ، سوف تتعلم كيفية بناء عمود فينوغرادسكي ، وتغيير ظروف النمو والركائز لإثراء مجتمعات ميكروبية محددة. أولا ، حدد موقع نظام بيئي مائي مناسب ، مثل البركة أو المستنقعات. يجب أن تأتي عينات الرواسب من المنطقة القريبة من حافة الماء ، وأن تكون مشبعة تماما بالماء. ثم استخدم مجرفة ودلو لجمع لتر إلى لترين من الطين المشبع. بعد ذلك ، احصل على ما يقرب من ثلاثة لترات من المياه العذبة من نفس المصدر والعودة إلى المختبر مع العينات الميدانية. في المختبر ، ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة ، بما في ذلك معطف المختبر والقفازات. الآن ، انقل ما يقرب من 750 مل من الطين إلى وعاء الخلط. بعد ذلك ، نخل الوحل لإزالة الصخور الكبيرة أو الأغصان أو الأوراق واستخدم ملعقة لتفكيك أي كتل. بعد ذلك ، أضيفي بعض الماء العذب إلى وعاء الخلط وقلبي بملعقة كبيرة. أضف الماء حتى يصبح قوام خليط الماء والطين مشابها لميلك شيك. استمر في التأكد من عدم وجود كتل. كتجربة اختيارية ، اختر البكتيريا المحبة للملح عن طريق إضافة 25 إلى 50 ملليغرام من الملح إلى خليط الطين. ثم انقل ما يقرب من 1/3 من خليط الماء والطين إلى وعاء خلط ثان. أضف صفار بيضة وحفنة من الجرائد المبشورة إلى الوعاء. بعد ذلك ، أضف هذا الخليط إلى العمود ، حتى يمتلئ بحوالي 1/4. بعد ذلك ، أضيفي خليط الماء والطين بدون البيضة والجرائد إلى العمود ، حتى يمتلئ بمقدار 3/4 تقريبا. ثم أضف المزيد من الماء إلى العمود ، مع ترك مساحة 1/2 بوصة في الأعلى. قم بتغطية العمود بغلاف بلاستيكي وثبته بشريط مطاطي. احتضن العمود في الضوء بالقرب من نافذة في درجة حرارة الغرفة لمدة أربعة إلى ثمانية أسابيع قادمة. طوال فترة الحضانة ، راقب التغييرات في عمود فينوغرادسكي مرة واحدة على الأقل في الأسبوع لتطوير طبقات ملونة مختلفة وتشكيل الفقاعات. بالإضافة إلى ذلك ، سجل الوقت الذي تستغرقه الطبقات المختلفة لتطويرها. تعديل آخر يمكن إجراؤه هو احتضان العمود بالقرب من المبرد لاختيار البكتيريا المحبة للحرارة ، أو في الثلاجة لاختيار البكتيريا المحبة للنفس. قم بتغيير ظروف الإضاءة عن طريق وضع أعمدة مختلفة في الإضاءة العالية أو الإضاءة المنخفضة أو الظلام لاحتضانها. بدلا من ذلك ، حدد الطول الموجي للضوء الوارد عن طريق تغطية العمود بظلال مختلفة من السيلوفان لتحديد الألوان التي تختارها للمجموعات البكتيرية المختلفة. لتجربة اختيارية أخرى ، لإثراء البكتيريا المؤكسدة للحديد ، أضف مسمارا إلى خليط الطين والماء قبل إضافة الجرائد وصفار البيض. بعد أسبوع إلى أسبوعين ، يشار إلى نمو طبقة البكتيريا الزرقاء بطبقة خضراء أو حمراء بنية أعلى طبقة الطين لعمود فينوغرادسكي الكلاسيكي. بمرور الوقت ، تتم مراقبة مظهر وتطور الطبقات المختلفة ، كل منها يشير إلى أنواع مختلفة من البكتيريا الموجودة. عند مقارنة عمود ينمو في الظلام بعمود فينوغرادسكي التقليدي ، نرى أن المعالجة المظلمة تنتج الطبقة السوداء في أسفل العمود ، مما يدل على البكتيريا المختزلة للكبريتات. قد ينتج عن العمود المظلم أيضا طبقات أخرى ، اعتمادا على ظروف الحضانة الأخرى. بالإضافة إلى ذلك ، لا ينتج العمود المظلم طبقة البكتيريا الزرقاء الخضراء ، ولا الطبقات الحمراء أو الأرجوانية أو الخضراء التي تشير إلى بكتيريا الأرجواني غير الكبريت والكبريت الأرجواني والكبريت الأخضر على التوالي. تعتمد هذه المجموعات على الضوء للنمو.

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

الأحياء المتقدمة

Microbiology

علم الأحياء الدقيقة

winogradsky column microbial layers and gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles.

The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon, usually cellulose, and sulfur are added, and the column is incubated in light. As microbes use these resources, they go through succession, which means one community replaces another as conditions change. This activity also creates gradients, or zones with changing chemical levels, especially for oxygen and sulfide.

At the top of the column, photosynthesizers grow first. These are mostly cyanobacteria, which make oxygen and often appear as a green or reddish-brown layer. Because oxygen is not very soluble in water, its concentration drops quickly below this zone. That creates an aerobic layer with oxygen at the top and an anaerobic layer with no oxygen below.

Deeper in the column, microbes that do not need oxygen can become active. At the bottom, organisms break down organic matter without oxygen, and fermentation of cellulose produces organic acids. Sulfate reducers then use these organics with sulfate and release sulfide. When iron reacts with sulfide, the sediment turns black and forms iron-sulfide minerals.

Sulfide also moves upward, so the middle of the column becomes a place where oxygen from above and sulfide from below meet. With enough light, sulfur-using photosynthesizers grow here. Green sulfur bacteria and purple sulfur bacteria often form green, purple, or purple-red layers. Green sulfur bacteria usually sit below purple sulfur bacteria because they tolerate more sulfide.

Above the purple sulfur bacteria, purple nonsulfur bacteria may form red, purple, orange, or brown layers. These microbes use organic acids as electron donors instead of sulfide. Higher up, nonphotosynthetic sulfur oxidizers can appear as white filaments. Bubbles may also form in the column. Oxygen bubbles in the aerobic layers come from cyanobacteria, while methane bubbles in the anaerobic layers are likely made by methanogens.

A mature Winogradsky column can show several microbial groups from top to bottom. Cyanobacteria are at the top, followed by nonphotosynthetic sulfur oxidizers, purple nonsulfur bacteria, purple sulfur bacteria, green sulfur bacteria, sulfate-reducing bacteria, and methanogens near the bottom. The visible colors, filaments, black sediment, and bubbles make the column a useful model for studying how microbes depend on one another in layered environments.

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

winogradsky-column-microbial-layers-and-gradients

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

Explore how a Winogradsky column forms microbial layers, oxygen and sulfide gradients, and visible signs of cyanobacteria, sulfur bacteria, and methanogens.

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

Description

Transcript