Name: counting bacteria with dilution plates
Uploaded: 2023-04-30T07:09:34.000Z
Duration: 10 min 53 s
Channel: JoVE

1. الإعداد
<ol>
	<li>يجب كتابة مخطط انسيابي يسرد جميع المواد والبروتوكول التجريبي التدريجي وطريقة التخلص من الإمدادات في دفتر مختبر والاحتفاظ به بالقرب من مساحة العمل التجريبية. </li>
	<li>يجب تعقيم مساحات العمل بمطهر مناسب (70٪ إيثانول) ويجب على المجرب التخفيف من مخاطر التلوث من خلال ارتداء ملابس مختبرية نظيفة تحميها أيضا من حالات التعرض الشاذة. تشمل الملابس المناسبة على سبيل المثال لا الحصر معطف المختبر ، وقفازات اللاتكس أو النتريل ، وأجهزة الغوغل ، وأجهزة التنفس ، والأحذية المغلقة. من الأهمية بمكان الحفاظ على تقنية المعقمة في جميع الأوقات. </li>
	<li>تحضير 90 مل من محلول ملحي 0.45٪. باستخدام أسطوانة نظيفة متدرجة ، قم بقياس 90 مل من الماء المعقم ونقله إلى قارورة إرلينماير نظيفة تحمل علامة 0.45٪ ملحية . تزن .405 جم من كلوريد الصوديوم (Sigma-Aldrich NaCl S9888) وأضفها إلى القارورة المسمى 0.45٪ محلول ملحي. قم بالتدوير بشكل متكرر حتى لا يبقى أي مذاب مرئيا. </li>
	<li>عند الانتهاء ، يجب على المجرب إعادة تعقيم جميع الأسطح والتخلص من أي كائنات غير مرغوب فيها أو مخزونات مخففة أو أطباق بتري أو حلقات تلقيح يمكن التخلص منها وفقا لإرشادات OSHA. يمكن إزالة ملابس المختبر قبل غسل اليدين. </li>
</ol>
2. إعداد الوسائط
<ol>
	<li>حدد الوسائط المناسبة لزراعة الكائن الحي المطلوب. في معظم السيناريوهات ، يمكن المرق من نمو بكتيريا كافية. نظرا لأن الكائنات الحية من بروتوكول فينوغرادسكي مرغوبة هنا ، فقد تم تجميع عمود يتكون من كربونات الكالسيوم والكبريت والسليلوز والطين وتركه دون إزعاج لمدة 7 أيام. يتم فصل العمود المذكور أعلاه إلى أقسام هوائية ودقيقة ولاهوائية. </li>
	<li>اختر وسيطا مناسبا لطلاء الكائن الحي محل الاهتمام. عادة ما يتم استخدام مكملات الوسائط السائلة مع أجار درجة علم الأحياء الدقيقة كعامل تصلب. LB متوسط / أجار كاف عند حصاد عينات من المناطق الهوائية والهوائية الدقيقة واللاهوائية من العمود المذكور أعلاه. ملاحظة: لم يتم حصاد عينات من المنطقة المحبة للميكرو لهذا الإجراء. ومع ذلك ، يجب زراعة هذه الكائنات الحية في برطمانات الشموع. يؤدي إدخال شمعة إلى غرفة الزراعة هذه قبل الختم إلى خلق بيئة منخفضة الأكسجين مناسبة لتكاثر الهوية الدقيقة. </li>
	<li>نظرا لأننا نرغب في تحضير 250 مل ، استخدم 500 مل (أو أكبر) قوارير Erlenmeyer لمنع الغليان عند التعقيم. قم بتسمية أحدهما "مرق" والآخر "أجار". </li>
	<li>حدد مقدار الوسائط المطلوبة لإنشاء كل حل باتباع توصيات تركيز الشركة المصنعة. يتم تحضير LB Agar ، المستخدم هنا ، عن طريق الجمع بين 25 جم / لتر والماء عالي النقاء. يتطلب حجمنا البالغ 250 مل محلولا من 6.25 رطل أجار / 250 مل من الماء. وبالمثل ، يتم تحضير مرق LB من خلال الجمع بين نفس نسبة مرق LB والماء. نظرا لأنه لا يتم استكماله بعامل تصلب ، فلن يتصلب عند تبريده. </li>
	<li>قم بوزن الوسائط واخلطها بالماء بنسب تتوافق مع توصيات الشركة المصنعة. أضف 6.25 جرام من LB Agar إلى قارورة تحمل علامة "أجار" ، و 6.25 جرام من مرق LB إلى قارورة تحمل علامة "مرق". أضف 250 مل من الماء فائق النقاء إلى كل قارورة. </li>
	<li>لف ورق الألمنيوم فوق كل قارورة واستخدم الأوتوكلاف لتعقيم الوسائط لمدة لا تقل عن 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة. </li>
	<li>باستخدام قفاز أو وسادة مقاومة للحرارة ، قم بإزالة القوارير من الأوتوكلاف عند اكتمال الدورة وضعها في حمام مائي 40-50 درجة مئوية. </li>
	<li>بمجرد الوصول إلى درجة الحرارة المناسبة ، اسكب محتويات القارورة المسماة "مرق" في 250 مل Erlenmeyer ، أو قارورة مستديرة القاع. قم بتسمية قارورة 250 مل "solution0". </li>
	<li>احصل على أطباق بتري معقمة مقاس 10 ، 100 مم × 15 مم وقم بتسميتها بالتاريخ والاسم ونوع الوسائط المستخدمة ومنطقة عمود فينوغرادسكي التي سيتم حصاد الكائنات الحية منها. </li>
	<li>قم بإزالة القارورة التي تحمل علامة "أجار" من الحمام المائي وابدأ في سكبها في كل من أطباق بتري ال 10. يجب عدم إضافة أكثر من 15 مل لكل طبق. يمكن إجراء ذلك أيضا باستخدام ماصة وماصة مصلية سعة 25 مل لتحسين الدقة. استخدم طرف ماصة معقم لإزالة أي فقاعات موجودة، ثم قم بتغطيتها بأغطية اللوحة واتركها لتتجلب طوال الليل. </li>
</ol>
3. تحضير مخفف 
<ol>
	<li>قم بإعداد عشرة أنابيب اختبار قادرة على تخزين 20 مل أو أكثر في رف وقم بتسميتها T1-T10. يتوافق كل رقم أنبوب مع عامل التخفيف الذي يتوافق معه (على سبيل المثال ، T4 = 1x10 -4 أو 0.0001 أو 1 / 10,000 من تركيز المخزون). </li>
	<li>Pipet 9 مل من محلول ملحي 0.45٪ في كل من أنابيب الاختبار ال 10. </li>
	<li>الفراغات المالحة جاهزة الآن للتعقيم بواسطة الأوتوكلاف. استخدم رقائق الألومنيوم لتغطية كل من أنابيب الاختبار ال 10 ثم انقلها إلى رف أنبوب اختبار متوافق مع الأوتوكلاف. تعقيم لمدة لا تقل عن 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية ، 15 رطل لكل بوصة مربعة. </li>
	<li>قم بإزالة الفراغات باستخدام قفازات مقاومة للحرارة واتركها لتبرد. قم بتغطيته وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لحين الحاجة عندما تصل الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة ، أو عندما تبرد عند لمسها. </li>
</ol>
4. زراعة الكائن الحي المستهدف 
<ol>
	<li>تلقيح "الحل0" بمستعمرة واحدة من صفيحة مخططة مسبقا أو 50 ميكرولتر من مخزون مجمد. اسمح للكائن الحي المستهدف بوقت التكاثر عن طريق وضع "الحل 0 " الملقح في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل مع الاهتزاز (إذا لزم الأمر). (ملاحظة: يجب تغطية القارورة لمنع التلوث. إذا كان الكائن الحي المستهدف هوائي ، فاستخدم شاشا معقما وسدادات قطنية لمنع التلوث. في حالة تقييم مناطق عمود فينوغرادسكي ، ما عليك سوى إزالة 1 جرام من كل منطقة مرغوبة (الهوائية واللاهوائية لأغراض هذه الدراسة) وإعادة التعليق في T1 قبل المتابعة إلى الخطوة 5.3. </li>
</ol>
5. التخفيف التسلسلي
<ol>
	<li>احصل على القارورة التي تحمل علامة "مرق المغذيات" من الحاضنة ورجها بقوة. </li>
	<li>Pipet 1 مل من "solution0" في أنبوب الاختبار المسمى T1. دوامة T1. في حالة تقييم مستخلصات Winogradsky ، قم بوزن 1 جرام من المنطقة المرغوبة وأضفها إلى T1 قبل الدوامة. (ملاحظة: يتم استخدام 1 مل هنا من أجل البساطة - يمكن أيضا استخدام كميات أصغر أو أكبر من المخفف). </li>
	<li>قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T1 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T2. دوامة T2. </li>
	<li>قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T2 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T3. دوامة T3. </li>
	<li>قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T3 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T4. دوامة T4. </li>
	<li>قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T4 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T5. دوامة T5. </li>
	<li>قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T5 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T6. دوامة T6. </li>
	<li>قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T6 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T7. دوامة T7. </li>
	<li>قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T7 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T8. دوامة T8. </li>
	<li>قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T8 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T9. دوامة T9. </li>
	<li>قم بإزالة 1 مل من أنبوب الاختبار T9 وأضفه إلى أنبوب الاختبار T10. </li>
</ol>
6. انتشار الطلاء 
<ol>
	<li>Pipet 100 ميكرولتر من عينة مخففة من T1 مباشرة على طبق بتري. يمكن تكرار هذه الخطوة ، ولكن لا يلزم أن تتكرر لكل أنبوب. </li>
	<li>احصل على قضيب نشر معقم يمكن التخلص منه أو تعقيم قضيب نشر الزجاج باللهب. في حركة في اتجاه عقارب الساعة / عكس اتجاه عقارب الساعة ، حرك الجزء الأفقي من قضيب الانتشار لتوزيع العينة بالتساوي داخل طبق بتري. </li>
	<li>كرر ذلك لكل منطقة من عمود فينوغرادسكي المراد تقييمها. </li>
	<li>احتضان الأطباق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. بالنسبة للكائنات اللاهوائية ، استخدم غرفة لاهوائية. </li>
</ol>
7. Streaking
<ol>
	<li>حدد التخفيف المناسب للكائن الحي المستهدف. على سبيل المثال ، سينتج عن الحل4 تخفيف 1/10,000 من تركيزك الأولي. عادة ما يتم تقييم تخفيفات 1/1,000th (T3/Solution) و 1/1,000,000th (T6/Solution6) و 1/1,000,000,000th (T9/Solution} ) لتعداد الميكروبات. </li>
	<li>باستخدام حلقة تلقيح بلاستيكية معقمة يمكن التخلص منها أو حلقة تلقيح معدنية قابلة لإعادة الاستخدام تعرضت للنيران لمدة لا تقل عن 10 ثوان ، انغمس في المحلول المطلوب من الخطوة 5. يجب أن تنقل حلقات التلقيح المعايرة 0.01 مل. (تحذير: لا تسمح للحلقة الملتهبة بملامسة البكتيريا فور إزالتها من الحرارة)</li>
	<li>ارفع غطاء طبق بتري قليلا على جانب واحد حتى تتمكن حلقة التلقيح فقط من الوصول إلى الأجار. حرك حلقة التلقيح عبر الجزء العلوي من الوسائط بطريقة متعرجة مع الحرص على عدم المساس بالأجار. اخفض غطاء طبق بتري. </li>
	<li>استخدم حلقة تلقيح جديدة يمكن التخلص منها أو أعد تعقيم الحلقة القابلة لإعادة الاستخدام. </li>
	<li>قم بتدوير اللوحة بمقدار 1/3 تقريبا rd (~ 118 درجة) وقلل من تكرار الحركة المتعرجة. </li>
	<li>مرة أخرى ، استخدم حلقة جديدة يمكن التخلص منها أو أعد تعقيم حلقة معدنية قبل الدوران النهائي وقلل من التردد المتعرج مرة أخرى. اخفض غطاء طبق بتري. </li>
	<li>كرر الخطوات 7.2 - 7.6 حتى يتم ربط ثلاثة أطباق بتري على الأقل لثلاثة تخفيفات مختلفة ، باستخدام حلقة جديدة يمكن التخلص منها أو عن طريق إعادة إشعال حلقة قابلة لإعادة الاستخدام ( الشكل 2 ). </li>
	<li>ضع أطباق بتري مخططة في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل. بالنسبة للكائنات اللاهوائية ، استخدم غرفة لاسروبية. </li>
</ol>
8. تحليل البيانات والنتائج 
<ol>
	<li>تم حصاد الثقافات من مناطق الأكسجين ونقص الأكسجين في عمود فينوغرادسكي لمدة 7 أيام. هذه المناطق مناسبة للكائنات اللاهوائية غير المتجانسة وأكسدة الحديد ، على التوالي. </li>
	<li>تم تخفيف النماذج المستخرجة للأعمدة بشكل متسلسل قبل الخطوط أو الانتشار على ألواح LB Agar. </li>
	<li>كشفت الخطوط عن مجموعة سكانية مختلطة من كل منطقة من مناطق فينوغرادسكي التي تم تقييمها. أسفرت لوحات الانتشار عن نتائج مماثلة. </li>
	<li>لحساب CFU / مل أو CFU / g ، متوسط عدد المستعمرات المحسوبة من ثلاث لوحات. اضرب متوسط عدد المستعمرات في عامل التخفيف واقسمه على الكمية المقتبسى. على سبيل المثال ، إذا تم حساب ما معدله 65 مستعمرة على أطباق تم تلقيحها ب 0.1 مل من المحلول 6 (T6) ، فإن الصيغة الموضحة سابقا ستساوي 650،000،000 CFU / mL. </li>
	<li>يمكن الآن اختيار مستعمرات معزولة من كل لوحة لاستخدامها في فحوصات التخصيب لتحديد هوية الأنواع. </li>
</ol>

يتطلب تعداد البكتيريا وعزل السلالة عن طريق الطلاء تركيزات يمكن التحكم فيها من الكائنات الحية المستهدفة. لذلك فإن الطلاء الناجح يتوقف على التخفيف التسلسلي. على هذا النحو ، تظل التقنيات المذكورة أعلاه حجر الزاوية في الفحص والتجريب الميكروبيولوجي. على الرغم من بساطتها حسب التصميم ، إلا أنه يمكن تعديل عوامل التخفيف وتقنية الطلاء من قبل المجرب لتعزيز النتائج دون المساس بسلامة كل طريقة. يمكن أن يكون تخطيط المراحل الأربع لنمو البكتيريا مفيدا عند توصيف الميكروبات المرغوبة. تتميز هذه المراحل ، التأخر ، والسجل ، والثابت ، والموت ، بالتغيرات في تكاثر البكتيريا. تتميز مرحلة التأخر بنمو بطيء بسبب التكيف الفسيولوجي ، والمرحلة اللوغاريتمية هي فترة التكاثر الأقصى التي تتميز بارتفاع أسي في الخلايا القابلة للحياة ، ثم يتم الوصول إلى المرحلة الثابتة بسبب القيود البيئية وتراكم السموم ، قبل مرحلة الموت حيث يبدأ عدد الخلايا في الانخفاض. يمكن تحقيق ذلك عن طريق التخفيف المتسلسل (أو التخفيف من خطوة واحدة لتجنب الالتباس) الحل0 كل ساعة لمدة 8 ساعات ، بدءا من الوقت0 (يجب إعادة المحلول0 إلى حاضنة الاهتزاز بعد كل تخفيف). احسب السجل10 من CFU / ml لمخفف واحد للوقت0 وارسم على المحور Y. كرر هذا الحساب للعينة من الوقت1 (تأكد من حساب CFU / mL باستخدام نفس عامل التخفيف مثل الوقت0). كرر حتى يتم رسم كل مرة (الوقت1-8) على المحور X.

التخفيفات التسلسلية والطلاء: التعداد الميكروبي

Serial Dilutions and Plating: Microbial Enumeration

المصدر: جوناثان ف. بليز 1 ، إليزابيث سوتر 1 ، وكريستوفر ب. كوربو 1 
1 قسم العلوم البيولوجية ، كلية فاغنر ، 1 طريق الحرم الجامعي ، جزيرة ستاتن نيويورك ، 10301 
يمكن أن يكون التقييم الكمي لبدائيات النوى مرهقا نظرا لوفرتها ، وميلها إلى التكاثر الأسي ، وتنوع الأنواع داخل السكان ، والاحتياجات الفسيولوجية المحددة. مما يضاعف هذا التحدي هو الطبيعة ذات المراحل الأربع التي تتكاثر فيها البكتيريا (التأخر والسجل والثابت والموت). تعد القدرة على تقدير تركيز الكائنات الحية الدقيقة بدقة ضرورية للتحديد والعزل والزراعة والتوصيف بنجاح (6). على هذا النحو ، استخدم علماء الأحياء الدقيقة التخفيف التسلسلي وتقنيات الطلاء المختلفة لأكثر من قرن من الزمان لتحديد الحمل البكتيري والفيروسي بشكل موثوق في بيئات المختبرات السريرية والصناعية والصيدلانية والأكاديمية (2،4،6). ظهرت أوصاف هذه المنهجية لأول مرة في عام 1883 عندما نشر العالم والطبيب الألماني روبرت كوخ عمله حول العوامل المسببة للأمراض المعدية (2). غالبا ما يشار إليها باسم والد علم الجراثيم الحديث ، أصبحت تقنيات كوخ المذكورة أعلاه المعيار الذهبي لتعداد الكائنات الحية الدقيقة ، القابلة للزراعة أو غير ذلك ، في جميع أنحاء العالم. 
التخفيف التسلسلي هو الاختزال المنهجي لكيان معروف أو غير معروف (مذاب ، كائن حي ، إلخ) من خلال إعادة تعليق متتالية لمحلول أولي (محلول 0 ) إلى أحجام ثابتة من مخفف سائل (فراغات). تتكون هذه الفراغات عادة من محلول ملحي بنسبة 0.45٪ ، على الرغم من أن التركيبة يمكن أن تكون متنوعة (7). بينما يمكن للمجرب اختيار أي حجم لكل مخفف ، فإنه غالبا ما يكون مضاعفا للعدد 10 ، مما يسهل التقليل اللوغاريتمي للعينة. على سبيل المثال ، يحتوي المحلول 0 على ما مجموعه 100 خلية الإشريكية القولونية معلقة في 10 مل من مرق المغذيات. إذا تمت إزالة 1 مل من المحلول 0 وإضافته إلى 9 مل من المحلول الملحي (المخفف 1 }) ، فإن المحلول الجديد (الحل 1 }) سيحتوي على 1/10 ال من التركيز الأولي ل الإشريكية القولونية . في هذا المثال، سيحتوي الحل الجديد (الحل1) على 10 خلايا الإشريكية القولونية. تكرار هذه العملية عن طريق إزالة 1 مل من المحلول 1 وإضافته إلى 9 مل أخرى من المحلول الملحي (المخفف 2 ) سينتج عنه محلول 2 ، يحتوي فقط على خلية الإشريكية القولونية . نظرا لأن كل محلول جديد (9 مل من المخفف + 1 مل من المحلول) يحتوي على إجمالي 10 مل ، يمكننا أن نستنتج أن عامل التخفيف لهذا التخفيض هو 10 أو أن هذا كان تخفيفا تسلسليا بمقدار 10 أضعاف ( الشكل 1 ). نظرا لأننا بدأنا فقط ب 100 خلية في هذا المثال ونقوم بالتخفيف بمعامل 10 ، فلا يلزم سوى خطوتين للوصول إلى الحد الأدنى المطلق للتركيز وهو خلية واحدة. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig1.jpg"> 
الشكل 1: التخفيف التسلسلي لمحلول المخزون. يضاف 1 مل من محلول المخزون (محلول 0 ) إلى الأنبوب 1 الذي يحتوي على 9 مل من محلول ملحي 0.45٪ (ملع 1 ) ؛ حاصل ضرب هذا الخليط هو الحل1. كرر ذلك عن طريق نقل 1 مل من الحل الذي تم إنشاؤه حديثا 1 وإضافته إلى الأنبوب 2. يستمر الاقتباس وإعادة التعليق بهذه الطريقة حتى يتم الوصول إلى الأنبوب النهائي ، مما يؤدي إلى تخفيف تركيز المخزون بمعامل 10 لكل منهما مع كل خطوة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </a>
التخفيف التسلسلي هو أبسط تقنية للحصول على تركيزات يمكن التحكم فيها من الكائن الحي المطلوب ويتم استكماله بخطوط ونشر أطباق بتري ، وهما اثنتان فقط من العديد من تقنيات الطلاء التي يستخدمها علماء الأحياء الدقيقة. هذه الفائدة من هذا النهج هي أن المجرب يمكنه حصاد سلالات نقية من نوع واحد أو فصل سلالات عن مجموعة مختلطة (7). يتم تحقيق الخطوط عن طريق إدخال كائن حي إلى وسط صلب (يتكون بشكل عام من الاغاروز) ينمو عليه إذا توفرت العناصر الغذائية المناسبة. سيؤدي كنس حلقة تلقيح معقمة برفق عبر الوسط (بحيث يبقى خط خفي) في نمط جيبي صلب إلى توزيع الكائن الحي بشكل متناسب مع تردد شكل موجة المجريب. سيؤدي تقسيم طبق بتري إلى أثلاث أو أرباع (خط ربعي) وتقليل تواتر كل خط مع إدخال منطقة جديدة من الطبق إلى تقليل عدد الكائنات الحية الدقيقة التي يمكن أن تشغل تلك المنطقة تدريجيا ، مما ينتج عنه مستعمرات مفردة بدلا من العشب البكتيري غير القابل للقياس الكمي. الطلاء المنتشر لا يخفف العينات بشكل إضافي ؛ يتم استخدام موزعة زجاجية معقمة لتوزيع كمية من وسائط التعليق عبر طبق بتري كامل ( الشكل 2 ). تنشأ المستعمرات التي تنمو على لوحة الانتشار من خلية واحدة ويمكن حساب كل مستعمرة في الطبق لتقدير عدد وحدات تشكيل المستعمرة لكل مليلتر (CFU) في تعليق معين ، ممثلة في CFU / مل (6) ( الشكل 3 ) الأجار الناعم والطلاء المقلد هي أشكال مختلفة من التقنيات المذكورة أعلاه وتسمح بعزل العاثيات وفحص الطافرة ، على التوالي (1،7). 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig2.jpg"> 
الشكل 2: خطوط اللوحة لتعداد البكتيريا وعزل السلالة. قم بتسمية الجزء السفلي من طبق بتري بمعلومات التعريف (اسم البكتيريا والتاريخ والوسائط) وقسمها إلى أثلاث. بعد اختيار التخفيف المناسب لعينة المخزون ، خذ حلقة تلقيح معقمة (يمكن التخلص منها أو ملتهبة) واغمرها في أنبوب الاختبار (هنا ، T3). ارفع غطاء طبق بتري قليلا على جانب واحد حتى تتمكن حلقة التلقيح فقط من الوصول إلى الأجار. حرك حلقة التلقيح عبر الجزء العلوي من الوسائط بطريقة متعرجة مع الحرص على عدم المساس بالأجار. قم بتدوير اللوحة بمقدار 1/3 تقريبا rd (~ 118 درجة) وقلل من تكرار الحركة المتعرجة. قم بتدوير الوقت النهائي وقلل من التردد المتعرج مرة أخرى. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10507/10507fig3.jpg"> 
الشكل 3: انتشار الطلاء. تم تعليق 1 جم من المنطقة الهوائية في T1 ثم تخفيفه بشكل متسلسل. يتم استخدام قضيب انتشار زجاجي معقم أو بلاستيكي يمكن التخلص منه لتوزيع اللقاح في جميع أنحاء كل طبق. تكرر هذا مع 1 غرام من المنطقة اللاهوائية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/10507/10507fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. </a>
كما هو الحال مع التخفيفات التسلسلية ، يتم استخدام مقياس لوغاريتمي للتعبير عن تركيز الكائنات الحية. يمكن تعداد عدد المستعمرات المزروعة في أطباق بتري القياسية التي يبلغ قياسها 100 مم × 15 مم يدويا (أو أتمتة بمساعدة المعالجة الحسابية) من خلال تحديد مجموعات النمو المعزولة. يجب تعريف الأعداد التي يقل مجموعها عن 30 أو أكثر من 300 على أنها قليلة جدا بحيث لا يمكن عدها (TFTC) أو كثيرة جدا بحيث لا يمكن عدها (TNTC) ، على التوالي. في حالة هذا الأخير ، يجب إجراء تخفيف تسلسلي لتقليل التركيز قبل إعادة طبق بتري جديد. متوسط عدد المستعمرات القائمة بذاتها المحددة من ثلاثة أطباق بتري منفصلة وضرب المتوسط في عامل التخفيف سينتج CFU / mL. سيؤدي رسم السجل 10 من CFU / mL مقابل الوقت إلى الكشف عن متوسط وقت توليد الكائن الحي (7).

Source: Jonathan F. Blaize1, Elizabeth Suter1, and Christopher P. Corbo1
1 Department of Biological Sciences, Wagner College, 1 Campus Road, Staten Island ...

في بعض الأحيان ، من أجل تحديد البكتيريا ودراستها ، نحتاج أولا إلى عزلها وإثرائها من العينة. على سبيل المثال ، يتم خلط العينات التي تم الحصول عليها من عمود فينوغرادسكي ، مما يعني أنها تحتوي على أنواع أو سلالات متعددة من البكتيريا ، لذا فإن دراسة بكتيريا فردية أو تعداد الأنواع المختلفة الموجودة قد يكون أمرا صعبا. تحقيقا لهذه الغاية ، عادة ما يتم استخدام تقنيات التخفيف والطلاء التسلسلي لتحديد الحمل البكتيري بشكل موثوق وعزل المستعمرات الفردية. التخفيف التسلسلي هو عملية يتم من خلالها تقليل تركيز الكائن الحي ، البكتيريا في هذا المثال ، بشكل منهجي من خلال إعادة التعليق المتتالية في كميات ثابتة من المخفف السائل. عادة ما يكون حجم المخفف من مضاعفات 10 لتسهيل الاختزال اللوغاريتمي للكائن الحي العينة. على سبيل المثال ، تتم إزالة جرام واحد من الرواسب أولا من منطقة فينوغرادسكي ذات الأهمية وإضافتها إلى 10 ملليلتر من وسط سائل مناسب. بعد ذلك ، يضاف مليلتر واحد من هذا التخفيف الأول إلى أنبوب آخر يحتوي على تسعة ملليلتر من المتوسط. يمكن تكرار العملية حتى يتم تحضير عدة تركيزات مختلفة من البكتيريا. التخفيف التسلسلي هو مفتاح تعداد البكتيريا في هذا المثال ، نظرا لأن العينات المختلطة من عمود فينوغرادسكي تحتوي على عدد غير معروف ، وغالبا ما يكون كبيرا ، من البكتيريا. بعد ذلك ، يتيح الطلاء المخطط والطلاء المنتشر عزل البكتيريا وتعداد البكتيريا داخل العينة ، على التوالي. يتم تحقيق الخطوط عن طريق إدخال عينة مخففة إلى قسم واحد من الوسط الصلب المكمل بالمغذيات ، والتي تنقسم إلى أثلاث. ثم ينتشر هذا اللقاح على كل ثلث من اللوحة بنمط متعرج. نظرا لأن أقسام مختلفة من اللوحة مخططة ، تعبر من العينة السابقة مرة واحدة فقط ، تنتشر العينة بشكل أكثر رقة. هذا يعني أنك قد تحتاج فقط إلى الابتعاد عن تخفيف واحد لتحقيق مستعمرات فردية في الأقسام اللاحقة. بعد الحضانة ، تسمح الصفائح المخططة بملاحظات مورفولوجيا المستعمرة ، وهي معلومات يمكن أن تساعد في التمييز بين الأنواع البكتيرية المختلفة. بدلا من ذلك ، إذا كان الهدف الرئيسي هو تعداد البكتيريا في العينة ، فيمكن استخدام الطلاء المنتشر في الطلاء المنتشر ، يتم توزيع حصة من عينة واحدة بالتساوي على كامل سطح الوسط الصلب. عادة ، نظرا لأننا لا نعرف الأعداد البكتيرية في العينة المختلطة ، يتم عمل لوحة انتشار لكل من التخفيفات أو عينة تمثيلية منها. بعد الحضانة ، يمكن إجراء التعداد باستخدام لوحات الانتشار هذه. يجب التخلص من أي لوحات يقل عدد المستعمرات فيها عن 30 ، لأن الأعداد الصغيرة عرضة لخطأ أكبر. وبالمثل ، يجب التخلص من أي عدد يزيد عن 300 لأن ازدحام المستعمرات وتداخلها يمكن أن يؤدي إلى التقليل من عدد المستعمرات. إذا تم تسجيل عدد المستعمرات لكل من هذه الأطباق المتبقية وضربها في عامل التخفيف ، ثم قسمها على الحجم المطلي ، فإن هذا ينتج عن وحدات تشكيل المستعمرة ، أو CFUs ، لكل مليلتر من التعليق. في هذا الفيديو ، سوف تتعلم كيفية التقييم النوعي والكمي لعينة تحتوي على بكتيريا معروفة ، والمجتمعات الميكروبية الموجودة في مناطق مختلفة من عمود فينوغرادسكي عن طريق التخفيف التسلسلي ، والطلاء المنتشر ، والطلاء الخطي. أولا ، ارتد أي معدات حماية شخصية مناسبة بما في ذلك معطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية. بعد ذلك ، قم بتعقيم مساحة العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول وامسح السطح. بعد ذلك ، اجمع قارورتين من Erlenmeyer سعة 500 مل وقم بتسمية مرق واحد والآخر أجار. لتحضير محلول أجار LB ، اخلطي ما يقرب من 6.25 جرام من أجار LB ، وثلاثة جرامات من الأجار التقني ، و 250 مل من الماء المقطر في القارورة المسمى أجار. ثم قم بإعداد مرق LB عن طريق الجمع بين 2. 5 غرامات من وسائط LB و 100 مل من الماء المقطر في القارورة التي تحمل علامة المرق. بعد تعقيم القوارير ، استخدم قفازا مقاوما للحرارة لإزالة القوارير من الأوتوكلاف ووضعها في حمام مائي من 40 إلى 50 درجة مئوية. بمجرد أن تصل درجة حرارة القوارير إلى 50 درجة مئوية ، قم بإعداد ثلاث حصص سعة 100 مل من محلول المرق بعناية وقم بتسمية كل محلول من محلول المخزون صفر. بعد ذلك ، اجمع 10 أطباق بتري معقمة وقم بتسميتها بالتاريخ والاسم ونوع الوسائط المستخدمة ومنطقة عمود فينوغرادسكي التي سيتم حصاد الكائنات الحية منها. ماصة 15 مل من أجار من قارورة أجار في كل طبق بتري. بعد ذلك، استخدم طرف الماصة لإزالة أي فقاعات، واستبدال أغطية اللوحة، والسماح لها بالتصلب على الجزء العلوي من المقعد طوال الليل. في اليوم التالي ، امسح سطح المقعد بنسبة 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، قم بتسمية 10 أنابيب اختبار سعة 20 مليلتر من T1 إلى T10 وضعها في رف. ماصة تسعة ملليلتر من محلول ملحي 45٪ في كل أنبوب. الآن ، قم بتغطية كل من أنابيب الاختبار ال 10 بشكل غير محكم بأغطيتها ونقلها إلى رف أنبوب اختبار متوافق مع الأوتوكلاف. بعد اكتمال الدورة ، قم بإزالة الفراغات المالحة باستخدام قفازات مقاومة للحرارة واتركها لتبرد. قم بتخزين الأنابيب في درجة حرارة الغرفة حتى تصل إلى حوالي 22 درجة مئوية. لزراعة كائن حي مستهدف معروف ، الإشريكية القولونية في هذا المثال ، قم بتلقيح 100 مل من المحلول صفر بمستعمرة واحدة من صفيحة مخططة سابقا. ثم قم بتغطية الأنبوب واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية. لتقييم مناطق عمود فينوغرادسكي ، أضف ما يقرب من جرام واحد من المواد من المنطقة الهوائية إلى T1 وأعد تعليقها عن طريق الدوامة. ثم كرر هذه العملية بجرام واحد من المواد من المنطقة اللاهوائية. قم بإزالة الأنبوب الذي يحتوي على محلول صفر ملقح بالإشريكية القولونية من الحاضنة ورجها. بعد ذلك ، قم بإدخال ملية واحدة من المحلول في أنبوب اختبار T1 ودوامة للخلط. قم بإزالة مليلتر واحد من المحلول من T1 وانقله إلى T2 ، مع الدوامة للخلط. كرر هذه العملية من خلال أنبوب T10. لتقييم المناطق الهوائية واللاهوائية لعمود فينوجرادسكي ، قم بإزالة مليلتر واحد من المحلول من كل أنبوب من أنابيب T1 المعدة مسبقا ونقله إلى أنابيب T2 المناسبة. بعد ذلك ، استمر في التخفيفات التسلسلية من خلال أنابيب T10 كما هو موضح سابقا. لنشر اللوحة ، قم بتقطيع 100 ميكرولتر من العينة المخففة من كل أنبوب T3 إلى طبق بتري المقابل. بعد ذلك ، استخدم قضيب نشر معقم لتوزيع العينة برفق على طبق بتري واستبدال غطاء اللوحة. كرر هذه العملية مع تخفيفات T6 و T9 ، كما هو موضح سابقا. احتضان الألواح التي تحتوي على كائنات هوائية في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. احتضان الصفائح التي تحتوي على كائنات لاهوائية في غرفة لاهوائية مضبوطة على 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، قم بإزالة ألواح التخفيف T3 و T6 و T9 من الحاضنة والغرفة اللاهوائية وانقلها إلى سطح المقعد. من خلال العمل مع لوحة واحدة في كل مرة ، قم بتمرير حلقة تلقيح معقمة عبر الجزء العلوي من الوسائط بنمط متعرج. ثم استبدل غطاء طبق بتري. بعد ذلك ، قم بتدوير اللوحة بمقدار 1/3 وقم بتعقيم الحلقة لتقليل تردد النمط المتعرج الذي تم إجراؤه مسبقا. مرة أخرى ، بعد تعقيم الحلقة ، قم بتدوير اللوحة بمقدار 1/3 ، وقلل من تردد النمط المتعرج مرة أخيرة ، واستبدل الغطاء. كرر طريقة الخطوط هذه للألواح المتبقية ، كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، ضع الصفائح المخططة التي تحتوي على كائنات هوائية في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل والصفائح المخططة التي تحتوي على كائنات لاهوائية في غرفة لاهوائية مضبوطة على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تم حصاد الثقافات من المناطق الهوائية واللاهوائية في عمود فينوغرادسكي لمدة سبعة أيام. بعد ذلك ، تم تخفيف الثقافات بشكل متسلسل قبل الخطوط والانتشار على ألواح أجار LB. كشفت الخطوط عن مجموعة مختلطة من كل منطقة من مناطق فينوغرادسكي التي تم تقييمها ، وأسفرت لوحات الانتشار عن نتائج مماثلة. سينتج عن الصفيحة المخططة من مجموعة مختلطة مستعمرات بكتيرية بأشكال وأحجام وقوام وألوان مختلفة. في المقابل ، أظهرت الصفائح المخططة والمنتشرة التي تحتوي على الكائن الحي المعروف ، الإشريكية القولونية ، وجود مجموعة متجانسة. بشكل عام ، من الأفضل حساب CFUs لكل مليلتر باستخدام متوسط عدد المستعمرات لثلاث لوحات منتشرة بنفس العينة وعامل التخفيف. اضرب متوسط عدد المستعمرات في عامل التخفيف واقسمه على الكمية المقتبسى. أخيرا ، يمكن استخدام المستعمرات المعزولة المختارة من كل لوحة في فحوصات التخصيب الإضافية لتحديد هوية الأنواع.

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

الأحياء المتقدمة

Microbiology

علم الأحياء الدقيقة

counting bacteria with dilution plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs.

Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed volume of diluent, or blank, such as 0.45% saline. When 1 mL is transferred into 9 mL of saline, the sample is diluted 10-fold. Repeating that step again lowers the concentration even more, and only two steps are needed in the example of 100 E. coli cells to reach a single cell.

Plating methods help separate microorganisms and make colonies visible. Streaking uses a sterile inoculating loop on agar, a solid growth medium, to spread cells across the plate. In a quadrant streak, the plate is divided into thirds or fourths, and each new area is streaked less often so fewer cells land there. This can produce single colonies instead of a bacterial lawn and can help isolate a pure strain from a mixed sample.

Spread plating uses a sterile glass spreader to distribute an aliquot over the whole petri dish. This method does not add another dilution step. The colonies that grow are counted as colony forming units, or CFU, which are reported as CFU/mL. Soft agar and replica plating are related methods. They can be used for bacteriophage isolation and mutant screening.

Colony counts are usually done on standard 100 mm by 15 mm petri dishes. Isolated colonies can be counted by hand or with computer tools. Plates with fewer than 30 colonies are too few to count, or TFTC. Plates with more than 300 colonies are too numerous to count, or TNTC. If a plate is TNTC, another serial dilution should be done before restreaking a new plate.

To estimate CFU/mL, scientists average the number of colonies from three separate plates and multiply by the dilution factor. The same log scale used in dilution work also helps show how organism concentration changes over time. Plotting log10 CFU/mL against time can reveal the mean generation time of the organism.

Counting Bacteria with Dilution Plates

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

Learn how serial dilution, streaking, and spread plating help scientists count bacteria, isolate colonies, and estimate CFU/mL in lab samples.

Counting Bacteria with Dilution Plates

Description

Transcript