Name: streak plate method for isolating bacteria
Uploaded: 2023-04-30T07:09:49.000Z
Duration: 9 min 3 s
Channel: JoVE

1. الإعداد
<ol>
	<li>يجب التعامل مع جميع الميكروبات كما لو كانت خطرة. ارتد دائما معطف المختبر والقفازات ، واربط الشعر الطويل للخلف ، وتأكد من حماية أي جروح بشكل جيد.</li>
	<li>جهز مساحة العمل عن طريق تعقيمها باستخدام 70٪ إيثانول.</li>
	<li>تأكد من أن ألواح أجار ، ومحلول (محاليل) العينات ، وإما صندوق من حلقات التلقيح البلاستيكية المعقمة مسبقا أو حلقة معدنية بالإضافة إلى لهب بنسن ، في متناول اليد. عادة ما يتم تعقيم الحلقات البلاستيكية التي يمكن التخلص منها مسبقا. يجب غمس الحلقات المعدنية في 70٪ من الإيثانول ، ثم تثبيتها بالقرب من المنطقة الزرقاء من لهب بنسن وتسخينها حتى تصبح ساخنة. اترك السلك يبرد عن طريق رفع غطاء اللوحة (قليلا فقط لمنع التلوث) والنقر عليه على الوسط المتصلب.</li>
	<li>قم بإنهاء كل إجراء بالتعقيم المتكرر لمساحة العمل وغسل / تعقيم شامل لليدين والمعصمين.</li>
</ol>
2. بروتوكول
<ol>
	<li>إعداد وسائل الإعلام
	<ol>
		<li>تحديد وإعداد وسط صلب (يحتوي عادة على 1.5٪ (وزن / حجم) أجار) من شأنه أن يحافظ على الأنواع البكتيرية / السلالة المستخدمة. امزج الوسط في زجاجة قادرة على استيعاب ضعف الحجم النهائي لتجنب الفائض عند التعقيم.</li>
		قم <li>بتعقيم الوسائط عن طريق وضع الزجاجة ، بغطاء شبه مشدود ، في الأوتوكلاف المضبوطة على 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.</li>
		<li>أغلق الغطاء بشكل صحيح بمجرد إزالة الزجاجة من الأوتوكلاف. إذا كان سيتم استخدام الوسائط قريبا ، فضع الزجاجة في حمام مائي مضبوطة على 45 درجة مئوية للحفاظ عليها في حالة سائلة. سوف يتجمد الأجار عند أي شيء أقل من 32-40 درجة مئوية ، ويمكن إعادة تسخينه لاحقا (عادة باستخدام الميكروويف) إلى نقطة انصهار عند 85 درجة مئوية.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>تحضير لوحة (أطباق) الثقافة
	<ol>
		<li>ضع علامة على قاعدة أطباق بتري المعقمة (عادة 100 × 15 مم) على الجانب أو الأسفل باسم المجرب والتاريخ ونوع الوسائط.</li>
		<li>صب 20-25 مل من وسط زراعة أجار 45 درجة مئوية (معد مسبقا) في كل من الألواح الملصقة. في حالة ظهور الرغوة على طول الحواف ، يجب إزالتها بسرعة باستخدام ماصة عادية وطرف معقم.</li>
		<li>ضع جميع الأغطية على الفور مرة أخرى على الأطباق لمنع التلوث.</li>
		<li>اسمح للأجار بالتصلب لمدة ساعتين تقريبا في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بمجرد ضبطها ، يجب لاحقا تخزين ألواح الاستزراع البكتيرية رأسا على عقب عند 4 درجات مئوية لتقليل التكثيف على السطح المتوسط.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>طلاء الخطوط
	<ol>
		<li>اغمر حلقة معقمة في اللقاح المطلوب وقم بتفريق العينة المجمعة على الفور في الربع الأول من اللوحة باستخدام حركة متعرجة (الشكل 1 ، I).</li>
		<li>أغلق الغطاء وأعد تعقيم حلقة التلقيح أو اجمع حلقة معقمة جديدة يمكن التخلص منها.</li>
		<li>قم بعمل 3-4 ضربات تشع من الربع الأول (يحتوي على مجموعة بكتيرية كثيفة نسبيا) باتجاه الربع الثاني من اللوحة (الشكل 1 ، II).</li>
		<li>أغلق الغطاء وأعد تعقيم حلقة التلقيح أو تخلص من الحلقة التي تستخدم لمرة واحدة واجمع حلقة معقمة جديدة.</li>
		<li>كرر هذه الخطوط المكونة من 3-4 ضربات من الربع الثاني إلى الربع الثالث ، ثم من الربع الثالث إلى الرابع ، باستخدام حلقة معقمة في كل مرة (الشكل 1 ، الثالث - الرابع).</li>
		<li>باستخدام حلقة معقمة ، قم بعمل ضربة أخيرة في نمط متعرج من الربع الرابع باتجاه منتصف اللوحة (الشكل 1 ، V). سيكون انتشار البكتيريا أقل في هذا المجال ، مما يسمح بشكل مثالي بإنشاء مستعمرات فردية من خلية أم واحدة قابلة للحياة.</li>
		<li>أغلق الغطاء وأغلقه (إذا لزم الأمر من قبل الأنواع البكتيرية) بالبارافيلم لمنع تدفق الهواء.</li>
		<li>اعتمادا على الأنواع / السلالة البكتيرية ، ضع لوحة الثقافة رأسا على عقب في بيئة مناسبة واحتضانها حتى تظهر المستعمرات البكتيرية (يمكن أن تظهر مستعمرات منفصلة في أي من منطقتي اللوحة حيث قد يختلف التركيز الأولي).</li>
		<li>لتوليد مجموعة بكتيرية نسيلة ، قم بإخراج صفيحة أخرى ، واستبدل اللقاح المطلي على اللوحة الأصلية بالخلايا المعزولة من مستعمرة واحدة من اللوحة الأصلية.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<div class = "chapter_text" id = "script_0" >
على طبق بتري ، إذا خضعت بكتيريا واحدة لجولات متعددة من التكاثر اللاجنسي ، فسيؤدي ذلك إلى تكوين مستعمرة نسيلية. ومع ذلك ، قد يكون الحصول على بكتيريا واحدة من عينة مختلطة ، مثل تعليق التربة ، أمرا صعبا. إذا تم أخذ حلقة واحدة من هذه الثقافة غير المتجانسة ، فيمكن أن تحتوي على ما يصل إلى تريليون بكتيريا فردية. لنشر هذا العدد الكبير من البكتيريا على سطح صفيحة أجار والحصول على مستعمرة واحدة ، حتى باستخدام نمط متعرج ، ستحتاج الحلقة إلى السحب بشكل مستمر على سطح ما يكفي من الألواح الموضوعة جنبا إلى جنب لتطويق جزيرة الحرية بأكملها. من الواضح أن العلماء لا يستخدمون هذا العدد الكبير من اللوحات. بدلا من ذلك ، يستخدمون تقنية تسمى طلاء الخط.
تعتمد تقنية لوحة الخطوط على التخفيف التدريجي لعينة بكتيرية ، ويتم إجراؤها على سطح الوسائط الصلبة لطبق بتري واحد. للبدء ، يتم تقسيم سطح الوسائط بصريا إلى خمسة أقسام عن طريق تعيين أربعة أجزاء من المحيط كأقسام أربعة أولى ، ومركز اللوحة كقسم خامس. سيؤدي ذلك إلى إنشاء خمس لوحات وسائط بشكل فعال من طبق بتري واحد. بعد ذلك ، باستخدام حلقة من اللقاح المطلوب ، يتم رسم القسم الأول باستخدام نمط متعرج. بعد ذلك ، يتم استخدام حلقة جديدة يمكن التخلص منها ، أو في حالة وجود حلقة سلكية ، يتم تعقيمها بموقد بنسن ، وإشعالها حتى تصبح حمراء ساخنة على طول السلك. هذا الاستخدام لحلقة جديدة ، أو حلقة تعقيم باللهب ، يزيل أي خلايا بكتيرية متبقية ، مما يساعد في تخفيف البكتيريا. ثم يتم تبريد الحلقة الساخنة في الهواء لبضع ثوان قبل سحبها عبر القسم الأول لإنشاء ثلاثة إلى أربعة خطوط منفصلة ، كل منها يحمل جزءا صغيرا فقط من البكتيريا في القسم الثاني. يتم ربط الأقسام المتبقية بنفس الطريقة ، باستخدام حلقة معقمة في كل مرة ، وتمريرة واحدة عبر الخط السابق.
باستخدام دورة الخطوط والتعقيم هذه ، يجب تخفيف تركيز البكتيريا في كل قسم لاحق بحيث يحتوي القسم الأخير على عدد قليل من البكتيريا الموجودة بشكل منفصل. عند الحضانة ، تتكاثر هذه البكتيريا المنفصلة لإنتاج مستعمرات نسيلة معزولة من الخلايا الوليدة ، والتي يشار إليها باسم وحدات تشكيل المستعمرة ، أو CFUs. يمكن حصادها وإعادة خطها للتأكد من أن العمل اللاحق يتضمن نوعا واحدا فقط من البكتيريا ، يشار إليه باسم الثقافة النقية. بالإضافة إلى عزل المستعمرات الفردية عن ثقافة البكتيريا المختلطة ، تستخدم تقنية طلاء الخطوط أيضا لتحديد سلالات خاصة بالوسائط ، أو تحديد مورفولوجيا المستعمرة البكتيرية ، أو تحديد الأنواع البكتيرية المختلفة. في هذا الفيديو ، سوف نوضح كيفية عزل المستعمرات أحادية البكتيريا من تعليق عينة مختلطة من البكتيريا عبر تقنية طلاء الخط.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
للبدء ، ارتد قفازات المختبر ومعطف المختبر. بعد ذلك ، قم بتعقيم مساحة العمل باستخدام 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، حدد وسيطا مناسبا يحافظ على الأنواع البكتيرية المستخدمة أو السلالة وابدأ في تحضير الوسائط. هنا ، يتم تحضير أجار LB الشائع عن طريق وزن عشرة جرامات من الوسائط المسحوقة المصنوعة مسبقا و 7.5 جرام من الأجار. أضف المكونات الموزونة والمجففة إلى زجاجة زجاجية قادرة على استيعاب ضعف الحجم النهائي لتجنب الفائض. ثم أضف 500 مل من الماء إلى الزجاجة ، وقم بتغطيتها بإحكام شبه محكم. قم بتعقيم الوسائط عن طريق وضع الزجاجة في الأوتوكلاف المضبوض على 121 درجة مئوية لمدة عشرين دقيقة. بعد الانتهاء ، استخدم قفازات مقاومة للحرارة أو وسادة ساخنة لإزالة الوسائط من الجهاز ثم قم بلف غطاء الزجاجة على الفور لإغلاقه بإحكام.
للاستخدام في نفس اليوم ، اترك الوسائط تبرد عن طريق وضع الزجاجة في حمام مائي ساخن إلى حوالي 45 درجة مئوية ، للحفاظ على الوسائط في حالة سائلة. بدلا من ذلك ، يمكن ترك الوسائط في درجة حرارة الغرفة لتخزينها في الحالة الصلبة. عند الحاجة ، ضع الزجاجة في الميكروويف مع الغطاء مفتوحا قليلا لإذابة الوسائط ، واترك الوسائط تبرد باستخدام حمام مائي 45 درجة مئوية.
بعد ذلك ، خذ كم من أطباق بتري المعقمة ، وباستخدام علامة دائمة ، قم بتسميتها بأسماء المحقق والوسائط بالإضافة إلى التاريخ. بعد ذلك ، انقل الحجم المطلوب من الوسائط إلى وعاء معقم ، وأضف المضادات الحيوية أو المكونات الحساسة الأخرى إذا لزم الأمر. هنا ، يتم خلط 50 مل من الوسائط مع 100 ميكرولتر من الكاناميسين للحصول على تركيز نهائي يبلغ 25 ميكروغرام لكل ملليلتر. قم بتدوير الأنبوب لضمان التوزيع المتساوي للمكونات المضافة في جميع أنحاء الوسائط. ببطء ، لتجنب تكوين الفقاعات ، اسكب 20 إلى 25 مل من وسط الثقافة 45 درجة مئوية تقريبا في كل من اللوحة. إذا ظهرت فقاعات أو رغوة ، فقم بإزالتها بسرعة باستخدام ماصة عادية وطرف معقم. ثم استبدل جميع الأغطية على الفور لمنع التلوث. اترك الأجار يتجمد في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل أو طوال الليل. بمجرد التصلب ، قم بتخزين ألواح الثقافة رأسا على عقب عند أربع درجات مئوية لتقليل التكثيف على سطح الوسط.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
لربط الثقافة المفضلة ، خذ أولا لوحة ثقافة نظيفة وقم بإزالة الغطاء. العمل بسرعة ، اغمر حلقة معقمة يمكن التخلص منها في اللقاح المطلوب ثم امسح الحلقة على الفور فوق الربع الأول من اللوحة باستخدام حركة متعرجة. استبدل غطاء الطبق ، وتخلص من حلقة التلقيح المستخدمة ، ثم حدد حلقة معقمة جديدة. باستخدام الحلقة الجديدة ، قم بعمل ثلاث إلى أربع ضربات عبر خط المسحة الأصلي المشع من الربع الأول ، والذي يجب أن يحتوي على مجموعة بكتيريا كثيفة نسبيا في الربع الثاني. أغلق الغطاء مرة أخرى ، وتخلص من الحلقة. مع حلقة جديدة ، كرر هذا الإجراء مرة أخرى ، ولكن هذه المرة تمتد من الربع الثاني إلى الربع الثالث. ثم ، مع حلقة جديدة مرة أخرى ، قم بعمل خط آخر من القسم الثالث إلى القسم الرابع من اللوحة. أخيرا ، باستخدام حلقة جديدة ، قم بضربة أخيرة بنمط متعرج من الربع الرابع باتجاه مركز اللوحة. سيكون انتشار البكتيريا أقل في هذه المنطقة ، مما يسمح بشكل مثالي بإنشاء مستعمرات فردية من خلية أم واحدة قابلة للحياة.
استبدل غطاء اللوحة ، وإذا كان ذلك مناسبا للأنواع البكتيرية ، فقم بإغلاق اللوحة بغشاء بارا لمنع تدفق الهواء. اقلب لوحة الثقافة رأسا على عقب لمنع قطرات التكثيف ، ثم ضعها في درجة حرارة مناسبة للنمو. هنا ، يتم ضبط الحاضنة على 37 درجة مئوية. اترك اللوحة تحتضن حتى تظهر المستعمرات البكتيرية. لتوليد مجموعة بكتيرية نسيلة ، حدد مستعمرة منفصلة واحدة من هذه اللوحة. الآن ، باستخدام الحلقة المعقمة ، المس المستعمرة المستهدفة ، وكما كان من قبل ، قم بعمل خط في الربع الأول من لوحة جديدة. استمر في تعقيم الحلقة بالتناوب وخط الأرباع المتبقية من اللوحة كما هو موضح سابقا ، وتنتهي بالتعرج إلى المركز. أغلق الطبق وضعه ليحتضن حتى تتشكل مستعمرات منفصلة. بمجرد نمو هذه المستعمرات ، فإنها ستمثل عادة سلالات نسيلة نقية.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
قد تحتوي صفيحة الخط الأولية على مستعمرات تنشأ من خلايا من أنواع بكتيرية مختلفة أو خلايا ذات تركيبة وراثية مختلفة ، اعتمادا على نقاء العينة. من خلال العزل اللاحق لمستعمرة واحدة ، حيث يتم اشتقاق جميع الوحدات من خلية أم مشتركة ، فإن إجراء الخطوط الثاني يولد مجموعة بكتيرية نسيلة نسبيا ، مناسبة لمزيد من التوصيف أو التلقيح في المرق.
</div>

تعد القدرة على الحصول على مستعمرة بكتيرية نقية وزراعتها أمرا ضروريا ، سواء في البيئات السريرية أو الأكاديمية. يتيح طلاء الخطوط عزل مجموعة الخلايا النسيلية نسبيا ، التي تنشأ من CFU مشترك ، والتي قد تكون ذات أهمية خاصة أثناء التشخيص أو لتوصيف إضافي للعزلة. يتم وضع عينة على وسط مغذي مناسب قائم على أجار وتحضينها حتى تصبح المستعمرات مرئية. يتم حصاد مستعمرة معزولة لاحقا وإعادة ربطها على طبق ثان.

الثقافات النقية وطلاء الخطوط: عزل المستعمرات البكتيرية المفردة من عينة مختلطة

Pure Cultures and Streak Plating: Isolation of Single Bacterial Colonies from a Mixed Sample

المصدر: Tilde Andersson1, Rolf Lood1 
1 قسم العلوم السريرية لوند ، قسم طب العدوى ، المركز الطبي الحيوي ، جامعة لوند ، 221 00 لوند ، السويد 
يبدو من المستحيل تحديد التنوع البيولوجي الميكروبي مذهل حقا مع ما يقدر بنحو تريليون نوع متعايش (1،2). على الرغم من أن المناخات القاسية بشكل خاص ، مثل البيئة الحمضية لمعدة الإنسان (3) أو البحيرات تحت الجليدية في القارة القطبية الجنوبية (4) ، قد يهيمن عليها نوع معين ، إلا أن البكتيريا توجد عادة في الثقافات المختلطة. نظرا لأن كل سلالة قد تؤثر على نمو سلالة أخرى (5) ، فقد أصبحت القدرة على فصل وزراعة مستعمرات "نقية" (تتكون من نوع واحد فقط) ضرورية في الإعدادات السريرية والأكاديمية على حد سواء. تتيح الثقافات النقية مزيدا من الفحوصات الجينية (6) والبروتينية (7) ، وتحليل نقاء العينة ، وربما الجدير بالذكر ، تحديد وتوصيف العوامل المعدية من العينات السريرية. 
تمتلك البكتيريا مجموعة واسعة من متطلبات النمو وهناك أنواع عديدة من وسائط المغذيات المصممة للحفاظ على كل من الأنواع غير المتطلبة والأنواع الحساسة (8). يمكن تحضير وسائط النمو إما في شكل سائل (كمرق) أو في شكل صلب قائم على أجار (عامل تبلور مشتق من الطحالب الحمراء). في حين أن التلقيح المباشر في المرق ينطوي على خطر توليد مجموعة بكتيرية متنوعة وراثيا أو حتى مختلطة ، فإن الطلاء وإعادة الخطوط يخلق ثقافة أنقى حيث يكون لكل خلية تركيبة جينية متشابهة للغاية. تعتمد تقنية لوحة الخط على التخفيف التدريجي لعينة ( الشكل 1 ) ، بهدف فصل الخلايا الفردية عن بعضها البعض. يمكن لأي خلية قابلة للحياة (يشار إليها فيما يلي باسم وحدة تشكيل المستعمرة ، CFU) التي تدعمها وسائل الإعلام والبيئة المحددة أن تجد لاحقا مستعمرة معزولة من الخلايا الوليدة من خلال الانشطار الثنائي. على الرغم من معدلات الطفرات السريعة داخل المجتمعات البكتيرية ، إلا أن هذه المجموعة الخلوية تعتبر عموما نسيلية. وبالتالي ، يضمن حصاد هذه المجموعة وإعادة خطوطها أن العمل اللاحق يتضمن نوعا واحدا فقط من البكتيريا. 
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/10509/10509fig1.jpg"> 
الشكل 1: تعتمد لوحة الخط على التخفيف التدريجي للعينة الأصلية. I) يتم تشتيت اللقاح في البداية باستخدام حركة متعرجة ، مما يخلق منطقة بها مجموعة بكتيرية كثيفة نسبيا. II-IV) يتم سحب الخطوط من المنطقة السابقة ، باستخدام حلقة تلقيح معقمة في كل مرة ، حتى يتم الوصول إلى الربع الرابع. V) تشكل الحركة المتعرجة النهائية الموجهة نحو منتصف الصفيحة منطقة تم فيها تخفيف اللقاح بشكل ملحوظ ، مما يسمح للمستعمرات بالظهور منفصلة عن بعضها البعض. 
يمكن أيضا دمج تقنية لوحة الخطوط مع استخدام الوسائط الانتقائية و / أو التفاضلية. سيمنع الوسط الانتقائي نمو كائنات معينة ( على سبيل المثال من خلال إضافة المضادات الحيوية) في حين أن الوسط التفاضلي سيساعد فقط في تمييز أحدهما عن الآخر ( على سبيل المثال من خلال انحلال الدم على ألواح أجار الدم). 
يكمن وراء كل العمل في علم الأحياء الدقيقة استخدام التقنيات المعقمة (المعقمة). يجب اعتبار كل مزرعة بكتيرية مسببة للأمراض حيث يوجد خطر النمو غير المقصود للسلالات الغادرة وتكوين الهباء الجوي وتلوث المعدات / الأفراد. لتقليل هذه المخاطر ، عادة ما يتم تعقيم جميع الوسائط والبلاستيك والمعادن والأواني الزجاجية من خلال التعقيم قبل الاستخدام وبعده ، مما يعرضها لبخار مشبع عالي الضغط عند حوالي 121 درجة مئوية يقضي بشكل فعال على أي خلايا عالقة. يتم تطهير مساحة العمل بشكل عام باستخدام الإيثانول قبل الاستخدام وبعده. يتم ارتداء معطف المختبر والقفازات دائما أثناء العمل مع العوامل المعدية.

قد تحتوي الصفيحة الخطية الأولية على مستعمرات تنشأ من خلايا ذات تركيب جيني مختلف أو (حسب نقاء العينة) من أنواع بكتيرية مختلفة ( الشكل 2 أ ). 
من خلال العزل اللاحق لمستعمرة واحدة ، حيث يتم اشتقاق جميع الوحدات من خلية أم مشتركة ، فإن إجراء الخطوط الثاني يولد مجموعة بكتيرية نسيلة نسبيا ، مناسبة لمزيد من التوصيف أو التلقيح في المرق ( الشكل 2 ب </...

Source: Tilde Andersson1, Rolf Lood1
1 Department of Clinical Sciences Lund, Division of Infection Medicine, Biomedical Center, Lund University, 221 00 ...

على طبق بتري ، إذا خضعت بكتيريا واحدة لجولات متعددة من التكاثر اللاجنسي ، فسيؤدي ذلك إلى تكوين مستعمرة نسيلية. ومع ذلك ، قد يكون الحصول على بكتيريا واحدة من عينة مختلطة ، مثل تعليق التربة ، أمرا صعبا. إذا تم أخذ حلقة واحدة من هذه الثقافة غير المتجانسة ، فيمكن أن تحتوي على ما يصل إلى تريليون بكتيريا فردية. لنشر هذا العدد الكبير من البكتيريا على سطح صفيحة أجار والحصول على مستعمرة واحدة ، حتى باستخدام نمط متعرج ، ستحتاج الحلقة إلى السحب بشكل مستمر على سطح ما يكفي من الألواح الموضوعة جنبا إلى جنب لتطويق جزيرة الحرية بأكملها. من الواضح أن العلماء لا يستخدمون هذا العدد الكبير من اللوحات. بدلا من ذلك ، يستخدمون تقنية تسمى طلاء الخط. تعتمد تقنية لوحة الخطوط على التخفيف التدريجي لعينة بكتيرية ، ويتم إجراؤها على سطح الوسائط الصلبة لطبق بتري واحد. للبدء ، يتم تقسيم سطح الوسائط بصريا إلى خمسة أقسام عن طريق تعيين أربعة أجزاء من المحيط كأقسام أربعة أولى ، ومركز اللوحة كقسم خامس. سيؤدي ذلك إلى إنشاء خمس لوحات وسائط بشكل فعال من طبق بتري واحد. بعد ذلك ، باستخدام حلقة من اللقاح المطلوب ، يتم رسم القسم الأول باستخدام نمط متعرج. بعد ذلك ، يتم استخدام حلقة جديدة يمكن التخلص منها ، أو في حالة وجود حلقة سلكية ، يتم تعقيمها بموقد بنسن ، وإشعالها حتى تصبح حمراء ساخنة على طول السلك. هذا الاستخدام لحلقة جديدة ، أو حلقة تعقيم باللهب ، يزيل أي خلايا بكتيرية متبقية ، مما يساعد في تخفيف البكتيريا. ثم يتم تبريد الحلقة الساخنة في الهواء لبضع ثوان قبل سحبها عبر القسم الأول لإنشاء ثلاثة إلى أربعة خطوط منفصلة ، كل منها يحمل جزءا صغيرا فقط من البكتيريا في القسم الثاني. يتم ربط الأقسام المتبقية بنفس الطريقة ، باستخدام حلقة معقمة في كل مرة ، وتمريرة واحدة عبر الخط السابق. باستخدام دورة الخطوط والتعقيم هذه ، يجب تخفيف تركيز البكتيريا في كل قسم لاحق بحيث يحتوي القسم الأخير على عدد قليل من البكتيريا الموجودة بشكل منفصل. عند الحضانة ، تتكاثر هذه البكتيريا المنفصلة لإنتاج مستعمرات نسيلة معزولة من الخلايا الوليدة ، والتي يشار إليها باسم وحدات تشكيل المستعمرة ، أو CFUs. يمكن حصادها وإعادة خطها للتأكد من أن العمل اللاحق يتضمن نوعا واحدا فقط من البكتيريا ، يشار إليه باسم الثقافة النقية. بالإضافة إلى عزل المستعمرات الفردية عن ثقافة البكتيريا المختلطة ، تستخدم تقنية طلاء الخطوط أيضا لتحديد سلالات خاصة بالوسائط ، أو تحديد مورفولوجيا المستعمرة البكتيرية ، أو تحديد الأنواع البكتيرية المختلفة. في هذا الفيديو ، سوف نوضح كيفية عزل المستعمرات أحادية البكتيريا من تعليق عينة مختلطة من البكتيريا عبر تقنية طلاء الخط. للبدء ، ارتد قفازات المختبر ومعطف المختبر. بعد ذلك ، قم بتعقيم مساحة العمل باستخدام 70٪ من الإيثانول. بعد ذلك ، حدد وسيطا مناسبا يحافظ على الأنواع البكتيرية المستخدمة أو السلالة وابدأ في تحضير الوسائط. هنا ، يتم تحضير أجار LB الشائع عن طريق وزن عشرة جرامات من الوسائط المسحوقة المصنوعة مسبقا و 7.5 جرام من الأجار. أضف المكونات الموزونة والمجففة إلى زجاجة زجاجية قادرة على استيعاب ضعف الحجم النهائي لتجنب الفائض. ثم أضف 500 مل من الماء إلى الزجاجة ، وقم بتغطيتها بإحكام شبه محكم. قم بتعقيم الوسائط عن طريق وضع الزجاجة في الأوتوكلاف المضبوض على 121 درجة مئوية لمدة عشرين دقيقة. بعد الانتهاء ، استخدم قفازات مقاومة للحرارة أو وسادة ساخنة لإزالة الوسائط من الجهاز ثم قم بلف غطاء الزجاجة على الفور لإغلاقه بإحكام. للاستخدام في نفس اليوم ، اترك الوسائط تبرد عن طريق وضع الزجاجة في حمام مائي ساخن إلى حوالي 45 درجة مئوية ، للحفاظ على الوسائط في حالة سائلة. بدلا من ذلك ، يمكن ترك الوسائط في درجة حرارة الغرفة لتخزينها في الحالة الصلبة. عند الحاجة ، ضع الزجاجة في الميكروويف مع الغطاء مفتوحا قليلا لإذابة الوسائط ، واترك الوسائط تبرد باستخدام حمام مائي 45 درجة مئوية. بعد ذلك ، خذ كم من أطباق بتري المعقمة ، وباستخدام علامة دائمة ، قم بتسميتها بأسماء المحقق والوسائط بالإضافة إلى التاريخ. بعد ذلك ، انقل الحجم المطلوب من الوسائط إلى وعاء معقم ، وأضف المضادات الحيوية أو المكونات الحساسة الأخرى إذا لزم الأمر. هنا ، يتم خلط 50 مل من الوسائط مع 100 ميكرولتر من الكاناميسين للحصول على تركيز نهائي يبلغ 25 ميكروغرام لكل ملليلتر. قم بتدوير الأنبوب لضمان التوزيع المتساوي للمكونات المضافة في جميع أنحاء الوسائط. ببطء ، لتجنب تكوين الفقاعات ، اسكب 20 إلى 25 مل من وسط الثقافة 45 درجة مئوية تقريبا في كل من اللوحة. إذا ظهرت فقاعات أو رغوة ، فقم بإزالتها بسرعة باستخدام ماصة عادية وطرف معقم. ثم استبدل جميع الأغطية على الفور لمنع التلوث. اترك الأجار يتجمد في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين على الأقل أو طوال الليل. بمجرد التصلب ، قم بتخزين ألواح الثقافة رأسا على عقب عند أربع درجات مئوية لتقليل التكثيف على سطح الوسط. لربط الثقافة المفضلة ، خذ أولا لوحة ثقافة نظيفة وقم بإزالة الغطاء. العمل بسرعة ، اغمر حلقة معقمة يمكن التخلص منها في اللقاح المطلوب ثم امسح الحلقة على الفور فوق الربع الأول من اللوحة باستخدام حركة متعرجة. استبدل غطاء الطبق ، وتخلص من حلقة التلقيح المستخدمة ، ثم حدد حلقة معقمة جديدة. باستخدام الحلقة الجديدة ، قم بعمل ثلاث إلى أربع ضربات عبر خط المسحة الأصلي المشع من الربع الأول ، والذي يجب أن يحتوي على مجموعة بكتيريا كثيفة نسبيا في الربع الثاني. أغلق الغطاء مرة أخرى ، وتخلص من الحلقة. مع حلقة جديدة ، كرر هذا الإجراء مرة أخرى ، ولكن هذه المرة تمتد من الربع الثاني إلى الربع الثالث. ثم ، مع حلقة جديدة مرة أخرى ، قم بعمل خط آخر من القسم الثالث إلى القسم الرابع من اللوحة. أخيرا ، باستخدام حلقة جديدة ، قم بضربة أخيرة بنمط متعرج من الربع الرابع باتجاه مركز اللوحة. سيكون انتشار البكتيريا أقل في هذه المنطقة ، مما يسمح بشكل مثالي بإنشاء مستعمرات فردية من خلية أم واحدة قابلة للحياة. استبدل غطاء اللوحة ، وإذا كان ذلك مناسبا للأنواع البكتيرية ، فقم بإغلاق اللوحة بغشاء بارا لمنع تدفق الهواء. اقلب لوحة الثقافة رأسا على عقب لمنع قطرات التكثيف ، ثم ضعها في درجة حرارة مناسبة للنمو. هنا ، يتم ضبط الحاضنة على 37 درجة مئوية. اترك اللوحة تحتضن حتى تظهر المستعمرات البكتيرية. لتوليد مجموعة بكتيرية نسيلة ، حدد مستعمرة منفصلة واحدة من هذه اللوحة. الآن ، باستخدام الحلقة المعقمة ، المس المستعمرة المستهدفة ، وكما كان من قبل ، قم بعمل خط في الربع الأول من لوحة جديدة. استمر في تعقيم الحلقة بالتناوب وخط الأرباع المتبقية من اللوحة كما هو موضح سابقا ، وتنتهي بالتعرج إلى المركز. أغلق الطبق وضعه ليحتضن حتى تتشكل مستعمرات منفصلة. بمجرد نمو هذه المستعمرات ، فإنها ستمثل عادة سلالات نسيلة نقية. قد تحتوي صفيحة الخط الأولية على مستعمرات تنشأ من خلايا من أنواع بكتيرية مختلفة أو خلايا ذات تركيبة وراثية مختلفة ، اعتمادا على نقاء العينة. من خلال العزل اللاحق لمستعمرة واحدة ، حيث يتم اشتقاق جميع الوحدات من خلية أم مشتركة ، فإن إجراء الخطوط الثاني يولد مجموعة بكتيرية نسيلة نسبيا ، مناسبة لمزيد من التوصيف أو التلقيح في المرق.

pure-cultures-streak-plating-isolation-single-bacterial-colonies-from

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

الأحياء المتقدمة

Microbiology

علم الأحياء الدقيقة

streak plate method for isolating bacteria

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures.

Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect each other's growth, separating them first makes later work more reliable.

Bacteria have many growth needs, so labs use different nutrient media. Some media are liquid broths, while others are solid and usually contain agar, a gelling agent from red algae. Growing bacteria directly in broth can produce a mixed or genetically diverse population, while plating and re-streaking supports a cleaner culture with cells that have very similar genetic makeup.

The streak plate technique works by progressive dilution of the sample across the agar surface. The sample is first spread in a zig-zag pattern, which creates a dense area of growth. Then a sterile inoculation loop is used to draw streaks from one section to the next, usually across four quadrants, until the final area is greatly diluted and separate colonies can form.

The method can also be paired with selective or differential media. Selective media stop certain organisms from growing, often by adding antibiotics. Differential media do not stop growth, but they help tell organisms apart, such as by showing hemolysis on blood agar plates.

Aseptic technique is essential in all microbiology work. Every culture should be treated as potentially pathogenic because of the risk of unwanted growth, aerosol formation, and contamination of equipment or people. To reduce this risk, media and glass, metal, and plastic tools are sterilized in an autoclave before and after use, workspace surfaces are disinfected with ethanol, and lab coat and gloves are worn when handling infectious agents.

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

streak-plate-method-for-isolating-bacteria

creating a winogradsky column: a method to enrich the microbial species in a sediment sample

creating-winogradsky-column-method-to-enrich-microbial-species

Winogradsky Column Microbial Layers and Gradients

A Winogradsky column shows how microbial layers form in mud and water over time. It is a clear, enclosed ecosystem that helps scientists grow sediment microbes that are hard to culture in a test tube or on a petri dish. By keeping conditions close to a microbe’s natural habitat, the column makes it possible to study organisms that help drive Earth’s biogeochemical cycles. The column is built from pond or wetland sediment mixed with water in a transparent container. Extra sources of carbon,...

serial dilutions and plating: microbial enumeration

serial-dilutions-and-plating-microbial-enumeration

Counting Bacteria with Dilution Plates

Counting bacteria with dilution plates helps microbiologists estimate how many cells are in a sample. Because bacteria can grow quickly and may be hard to count directly, serial dilution and plating make the concentration easier to measure. These methods have been used for more than a century to study bacterial and viral loads in clinical, industrial, pharmaceutical, and academic labs. Serial dilution reduces a sample in steps. A small volume of the original solution is moved into a fixed...

enrichment cultures: culturing aerobic and anaerobic microbes on selective and differential medias

enrichment-cultures-culturing-aerobic-anaerobic-microbes-on-selective

Selective Media for Bacterial Isolation

Selective media help scientists isolate bacteria by supporting some microbes and blocking others. This lab also uses differential media, which reveal a visible chemical trait in the organism being grown. Together, these methods help identify bacteria from mixed samples. Prokaryotic cells live in almost every environment on Earth. They also show wide metabolic diversity, so the growth medium must supply the molecules they need for energy. Some microbes are extremophiles, meaning they live in...

pure cultures and streak plating: isolation of single bacterial colonies from a mixed sample

The streak plate method is used to isolate single bacterial colonies from a mixed sample. It helps separate one bacterial type from another so a pure culture can be grown. This is important in both clinical and research settings, where bacteria often grow together in mixed cultures. Pure cultures are needed for later genetic and protein studies. They are also used to check whether a sample is pure and to identify infectious agents from clinical samples. Because different strains can affect...

16s rrna sequencing: a pcr-based technique to identify bacterial species

16s-rrna-sequencing-pcr-based-technique-to-identify-bacterial

Bacterial ID with 16S rRNA Gene Sequencing

Bacterial identification with 16S rRNA gene sequencing helps scientists tell bacterial species apart. It is used in microbial ecology to study biodiversity in environmental samples and in medical microbiology to help diagnose infected patients. Traditional methods include microscopy, growth on specific media, biochemical and serological tests, and antibiotic sensitivity assays. Molecular methods have changed how bacteria are identified. 16S ribosomal RNA (rRNA) gene sequencing is often faster...

growth curves: generating growth curves using colony forming units and optical density measurements

growth-curves-generating-growth-curves-using-colony-forming-units

Bacterial Growth Stages and Cell Counts

Bacterial growth stages and cell counts show how a culture changes over time. This page follows a batch culture as it moves through lag, exponential, stationary, and death phases. It also shows how colony forming units, or CFU, and optical density can be used to measure that growth. Lag phase is the time bacteria need to adjust to a new environment before fast division begins. During exponential phase, cells grow and divide at the fastest rate, and DNA replication, RNA transcription, and...

antibiotic susceptibility testing: epsilometer tests to determine mic values of two antibiotics and evaluate antibiotic synergy

antibiotic-susceptibility-testing-epsilometer-tests-to-determine-mic

Measuring Bacterial Resistance with E-Tests

Measuring bacterial resistance with E-tests helps show how strongly an antibiotic can stop growth. The method is used to find the minimal inhibitory concentration, or MIC, which is the lowest antibiotic level that prevents visible bacterial growth. It is a practical way to study resistance in bacteria and compare how different antibiotics perform. The E-test uses a plastic strip that contains a built-in antibiotic gradient. The strip is placed on an agar plate that has been inoculated with...

microscopy and staining: gram, capsule, and endospore staining

microscopy-and-staining-gram-capsule-and-endospore-staining

Bacterial Stains for Cell Walls and Spores

Bacterial stains help scientists see cell walls, capsules, and endospores with a compound light microscope. Many bacteria are hard to tell apart with light alone because they are small, colorless, and can look similar under the lens. Staining makes these hidden features visible and helps identify different bacteria. A compound microscope uses more than one lens to magnify a sample. Its objective lens collects light near the specimen, and the eyepiece enlarges the image. Many compound...

plaque assay: a method to determine viral titer as plaque forming units (pfu)

plaque-assay-method-to-determine-viral-titer-as-plaque-forming-units

Phage Plaque Test for Counting Viruses

Bacteriophages, or phages, are viruses that infect prokaryotic cells. The plaque assay is a classic way to count these viruses by measuring viral titer, which is the amount of virus in a sample. It was first described in 1952 and is still one of the most reliable methods for determining viral titer. Phages were identified in the early 20th century by Twort and d'Hérelle. They have since been recognized for their therapeutic value and for their role in human and global ecosystems. Interest in...

transformation of e. coli cells using an adapted calcium chloride procedure

transformation-e-coli-cells-using-an-adapted-calcium-chloride

Calcium Chloride DNA Uptake in E. coli

Calcium chloride treatment can help E. coli take up foreign DNA. This chemical transformation method is used in molecular biology to move a plasmid into bacterial cells and then identify the cells that received it. The protocol described here uses chemically competent E. coli DH5α cells and the plasmid pUC19 to measure transformation efficiency. Bacteria can exchange genetic material through horizontal gene transfer. The three main routes are transformation, transduction, and conjugation.

conjugation: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

conjugation-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from-donor-to

Bacterial Gene Transfer by Conjugation in E. coli

Bacterial conjugation is a form of horizontal gene transfer in E. coli that moves DNA from one cell to another through direct contact. It was first discovered by Lederberg and Tatum in 1946. Unlike transformation or transduction, conjugation is a natural, one-way transfer of DNA from a donor cell to a recipient cell. This process can increase bacterial genetic diversity. It is often described as a type of bacterial mating. It has also helped drive the spread of antibiotic-resistant bacteria.

phage transduction: a method to transfer ampicillin resistance from donor to recipient e. coli

phage-transduction-method-to-transfer-ampicillin-resistance-from

Using P1 Phage to Move Antibiotic Resistance in E. coli

Bacteriophage transduction moves DNA between bacteria by using a phage, or bacterial virus, as the carrier. In this process, a phage can deliver genetic material from one bacterium to another. The method is a form of horizontal gene transfer and is important in both bacterial evolution and laboratory genetics. Phages were first described in the early 1900s, and transduction was named in 1951 by Norton Zinder and Joshua Lederberg. The transcript describes two main phage classes. Lytic phages...

microbiology

This collection demonstrates the key tools of microbiological investigation, including proper sterile technique and plating, how to use selective media and enrich samples, and culturing methods for mixed or pure samples. Additionally, it looks at common methods for identifying microbial isolates, as well as procedures for the genetic manipulation of bacteria.

Learn how streak plating separates bacteria from mixed samples, supports pure cultures, and uses selective media and aseptic technique in microbiology labs.

Streak Plate Method for Isolating Bacteria

Description

Transcript