تقليديا قد استخدمت شريحة الرأسي وإعداد كامل جبل الشبكية لدراسة وظيفة الدوائر الشبكية. هنا ، نحن تصف الرواية تشريح طريقة للحفاظ على مورفولوجيا شجيري الخلايا العصبية في الشبكية سليمة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تقليديا قد استخدمت شريحة الرأسي وإعداد كامل جبل الشبكية لدراسة وظيفة الدوائر الشبكية. ومع ذلك ، فإن العديد من الخلايا العصبية للشبكية ، مثل خلايا عديمة المحوار ، وتوسيع هذه التشعبات أفقيا ، بحيث يفترض أن مورفولوجيا الخلايا لتكون تضررت بشدة في شرائح عمودية. في إعداد كل جبل ، وخاصة بالنسبة للتصحيح ، المشبك التسجيلات والخلايا العصبية للشبكية في الطبقة الوسطى لا يمكن الوصول إليها بسهولة بسبب تغطية واسعة من الخلايا الدبقية endfeets ق (مولر الخلية). هنا ، نحن تصف الرواية تشريح طريقة للحفاظ على مورفولوجيا شجيري الخلايا العصبية في الشبكية سليمة. قدم شريحة أفقيا في الطبقة الداخلية للشبكية باستخدام تقطيع vibratome بعد جزءا لا يتجزأ من شبكية العين في هلام ذوبان agarose درجات الحرارة المنخفضة. في هذا التحضير شريحة أفقية من شبكية العين ، درسنا وظيفة الخلايا العصبية للشبكية مقارنة مورفولوجيا بهم ، وذلك باستخدام التصحيح ، المشبك تسجيل والكالسيوم تقنية التصوير ، وكيمياء سيتولوجية مناعية وحيدة الخلية RT - PCR.
البروتوكول
- تعد كتلة آغار (30 ملغم / لتر ، أي بنسبة 3 ٪ ، في الماء المقطر). حل أولا والميكروويف وسكبه في صحن الزجاج. الحفاظ على طبق في الثلاجة على 4 درجة مئوية.
نصيحة : يجب أن تكون على استعداد كتلة آغار مقدما.
- تعد درجات الحرارة المنخفضة ذوبان agarose هلام (25 ملغم / لتر ، أي بنسبة 2.5 ٪ في المتوسط). حل وأنها الميكروويف. يبقيه في حمام ماء ساخن على 35 درجة مئوية.
نصيحة : حافظ على agarose هلام يست ساخنة جدا. إذا كان الجو حارا جدا ، فإنه يأخذ وقتا طويلا لتكون طدت ، وهلام قد قتل في شبكية العين
. - الموت ببطء الحيوان ، واستأصل an مقلة العين وفتحه بمثابة فنجان العين. لتسييل النكتة الزجاجي ، وغارقة في فنجان العين فتح لمدة 10 دقيقة في هيالورونيداز في المتوسط (0.07 ملغ / مل) ، إذا بالضرورة.
- قطع أجار في كتلة (على سبيل المثال ، 1 سم × 1.5 سم لشبكية العين الماوس) ، وترتبط بقوة على المسرح vibratome بواسطة الغراء الفورية. الحفاظ على كتلة آغار الرطب.
- مكان النصل في 5 درجة في تقطيع اللحم. خفض بلطف السطح العلوي من كتلة آغار بسرعة تقريبا. 50 ميكرون / ثانية ، التكرار. 50 هرتز.
نصيحة : تأكد من أن السطح العلوي من كتلة آغار ناعمة ومسطحة تماما. قد تكون هناك حاجة تخفيضات عدة (على الأقل 3 مرات) للحصول على سطح أملس ومسطحة من كتلة آغار.
- شطف فنجان العين مع وسيط وبدون هيالورونيداز. عزل الشبكية من الظهارة الصبغية ووضعه مبصرة جنب على قطعة من ورق الترشيح. تعلق بحزم لشبكية العين ورقة الترشيح ، والفراغ في شبكية العين على ورقة الترشيح عدة مرات.
نصيحة : تأكد من أن تعلق في الشبكية إلى ورقة الترشيح مسطح تماما. بعد وضع شبكية العين على ورقة الترشيح ، وقطع ورقة فائض التصفية المحيطة الشبكية (Fig.2A). ورقة فائض التصفية كثيرا ما يمنع شفرة من الخوض في الطبقة المناسبة لشبكية العين.
- يمسح برفق المتوسطة الزائد على الكتلة آغار والمكان بعناية على شبكية العين ورقة الترشيح على كتلة آغار. بحزم لوضع ورقة الترشيح على كتلة آغار ، نعلق الغراء الفورية على حافة ورقة الترشيح.
نصيحة : لتجنب صدع unexpectable ، ضع الشبكية الأمامية وممكن على السطح العلوي من كتلة آغار.
- تصب بلطف agarose هلام درجات الحرارة المنخفضة لإذابة على شبكية العين. انتظر 1 دقيقة وتصب بلطف المتوسطة على ذلك لتبريده. الجل agarose يصبح توطد بسرعة.
نصيحة : حار جدا agarose هلام تقتل الشبكية.
- رفع مكانة نصل الى عدة مئات ميكرومتر فوق السطح العلوي للكتلة آغار وخفض بلطف الجزء العلوي من هلام agarose طدت.
- انخفاض أسفل موقف النصل. قطع الشبكية على مستوى الثلث القريبة من الطبقة النووية الداخلية (تقريبا في ما بين 200 و 250 ميكرومتر فوق السطح العلوي للكتلة آغار).
نصيحة : سوف سرعة الكثير من النصل تلف شبكية العين بشدة. تقريبا. 50 ميكرون / ثانية (50 هرتز) هو الخيار المناسب.
- لاحظ أن الخلايا عديم الاستطالات هي الآن وجها لأسفل. اختيار بعناية شريحة من شبكية العين مع هلام agarose عزز وضعه وجها في برلمان أو طبق.
نصيحة : لأن شبكية العين الماوس صغيرة ومتموجة ، فمن الصعب الحصول على شريحة مثالية الأفقي في طبقة المناسب. يجوز لل"منحرف" شريحة هي وسيلة بديلة للحصول على شريحة النسبية المسطحة من شبكية العين. للحصول على شريحة المائلة ، وضعت ورقة أخرى في تصفية بين شبكية العين على ورقة الترشيح وكتلة أغار على النحو المبين في Fig.2B. على الرغم من أنك لا يمكن أن نتوقع الكمال شريحة أفقية ، وهناك دائما بعض المناطق حيث سوما الخلية هو عديم الاستطالات على سطح الشريحة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هناك مزايا عديدة مهمة إعداد شريحة الأفقي للشبكية العين.
الأول ، هو الحفاظ على التشكل من الخلايا التي تعمل على توسيع التشعبات أفقيا ، مثل خلايا عديم الاستطالات والخلايا الأفقية. فقد تبين أن هناك أكثر من 20 نوعا من الخلايا في الشبكية عديم الاستطالات (ماكنيل وMasland ، 1998) ، بحيث أنه من المهم جدا لمقارنة مورفولوجيا الخلايا مع الخاصية الفسيولوجية.
الثانية ، في شبكية العين كلها جبل ، وتغطية واسعة من الخلايا ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وأجريت جميع البروتوكولات التجريبية وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية للاستخدام الحيواني.
شكر وتقدير
نشكر الدكاترة. H. ريتشارد Masland وكانيكو Akimichi لإعطائنا النصائح واقتراحات قيمة لتأسيس الداخلي لإعداد شريحة الأفقي للشبكية العين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| آجار | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| أجاروز L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | أجاروز منخفض درجة حرارة الانصهار |
| هيالورونيداز | Sigma-Aldrich | النوع I-S، 300 U/mg | |
| وسط زراعي | بتركيز mM: 102 NaCl، و3.1 KCl، و2.0 CaCl2، و1.0 MgCl2، و23 NaHCO3، و10 جلوكوز، مع الحفاظ على pH 7.8، أو محلول Ames’ (Sigma) | ||
| ميكروويف | |||
| حمام مائي ساخن | 35 °C | ||
| قاطعة Vibratome | Leica Microsystems | VT1000S | |
| مرشحات غشائية MF | EMD Millipore | HAWP01300 | ورق ترشيح، حجم المسام 0.45 µm |
| أدوات تشريح | ملقط، شفرة، ملقط صغير، ملقط دقيق، إلى أخره. | ||
| غراء فوري | مثل Alonalpha، وKrazy Glu | ||
| حقنة 50 mL | |||
| مرشح حقنة | EMD Millipore | SX0001300 |
المراجع
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
