يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ المناعية

15.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/1108

⸱

مارس 28, 2009

 ,  , 
1Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University College of Physicians and Surgeons

في هذه المقالة

ملخص

هذا البروتوكول يوضح كيفية تنفيذ المناعية على يرقة ذبابة الفاكهة تشريح.

البروتوكول

قبل أن تبدأ

  1. إعداد الحلول التالية : PBT (0.1 ٪ X100 تريتون في برنامج تلفزيوني 1X) ، PBTB (0.2 ٪ في جيش صرب البوسنة PBT) ، وPBTN (خ ع 2 ٪ في PBTB).
  2. تشريح ذبابة الفاكهة اليرقات. يرجى الاطلاع على ذبابة الفاكهة تشريح NMJ اليرقات.

المناعية

  1. نقل اليرقات إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على PBT. غسل اليرقات مرتين لمدة 15 دقيقة في PBT. ملاحظة : أن يغسل ، ووضع أنبوب مل 1.5 على خلاط nutator. إزالة السائل مع pippetor واستبدالها السائلة الطازجة.
  2. إزالة PBT. يغسل في PBTB مرتين لمدة 30 دقيقة.
  3. إزالة PBTB. يغسل في PBTN مرتين لمدة 15 دقيقة.
  4. في احتضان الضد الأولية مخففة في PBTN في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
  5. شطف مرتين مع PBTB. ملاحظة : حل لشطف إضافة وإزالة بسرعة.
  6. تغسل مرتين لمدة 15 دقيقة في PBTB.
  7. يغسل في PBTN لمدة 30 دقيقة.
  8. في احتضان الضد الثانوية (والضد الأولية مترافق إذا كنت تستخدم واحد) في PBTN المخفف.
  9. تغطي في البربون واحتضان مقابل 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  10. شطف مرتين مع PBTB.
  11. تغسل مرتين لمدة 15 دقيقة مع PBTB.
  12. الشروع في التركيب.

متزايد

ملاحظة : في جبل الجلسرين إذا كان سيتم تصوير العينات على الفور. جبل الذهب في إطالة ما اذا كان سيتم تخزين العينات قبل التصوير (لأكثر من أسبوع) ، أو إذا كان يجب التقط عينات عدة مرات. للاستخدام ، وضع زجاجة من إطالة في 65 º C حمام الماء لمدة 2-3 دقائق. يأخذ قسامة من الذهب وإطالة البقاء على على كتلة حرارة 45-50 درجة مئوية في

  1. صب محضرات الملون في PBT إلى كوب ووتش.
  2. وضع بعض الجلسرين على شريحة زجاجية نظيفة للمعالجة.
  3. نقل الحيوانات إلى شريحة المعالجة من قبل انتشالها من الزجاج ووتش زاوية باستخدام ملقط. ضمان أن تكون بشرة الجانب الأسفل.
  4. إزالة الرأس والذيل مع شفرة حلاقة جديدة على معالجة شريحة زجاجية. وexacto سكين مع شفرة # 16 يعمل بشكل جيد لهذا الغرض.
  5. على شريحة أخرى (تركيب الشريحة) ، وضع قطرة صغيرة من الجلسرين / إطالة وانتشاره مع ملقط نظيفة.
  6. تشريح الحيوانات نقل إلى الشريحة المتزايدة التي ميزتها ، مع الحرص على عدم قلب لهم. محاولة تحميل لهم في الصفوف في اتجاه واحد. جبل 6-8 الحيوانات لكل شريحة.
  7. انخفاض زلة تغطية على حافة طريق وضع في الجلسرين / إطالة والإفراج عن ببطء.
  8. ختم الشريحة مع طلاء الأظافر. علما [لا صورة حتى طلاء الأظافر جافة. هذا عادة ما يستغرق عشر دقائق. للعينات التي شنت في إطالة الذهب ، والسماح للشرائح الجافة لثلاث ساعات على الأقل قبل الختم أو التصوير.]

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

المناعية (IHC) أمر حيوي لدراسة البيولوجيا NMJ لأنه يمكن تصور من NMJ. ويتم إنجاز هذا باستخدام الأجسام المضادة التي تعترف غشاء الخلايا العصبية (على سبيل المثال ، HRP) ، وpresynapse (على سبيل المثال ، CSP ، SYT) ، و / أو postsynapse (على سبيل المثال ، DLG). ويمكن أيضا الإشارة الجزيئات والبروتينات الهيكلية ، أو البروتينات الرواية تكون المصلحة الملون. ثم ، يمكن أن تحور الجينات أو missexpressed ، ويمكن الكشف عن اضطراب IHC هيكل متشابك و / أو الإشارات العصبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المجهر المجسم “Stemi” 2000Carl Zeiss, Inc.495101-9804-000
مصدر الضوء KL 1500 LCDCarl Zeiss, Inc.000000-1063-181
ملقط Dumont SSFine Science Tools11200-33
ملقط Dumont #5Fine Science Tools11252-20
خلاط Nutator Adams™BD Biosciences421105
سكين دقيق رقم 1X-Acto3201
شفرات رقم 16X-Acto216
كاشف ProLong Gold Antifade لمنع البهتانInvitrogen36930

المراجع

  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster. J. Physiol. 262, 189-214 (1976).
  2. Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae. J Neurosci. 9, 710-725 (1989).
  3. Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).
  4. Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

PBT
ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ المناعية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.