مقالة منهجية

المستضد CD4 + تصور معين باستخدام خلايا T MHC الدرجة الثانية Tetramers

DOI:

10.3791/1167

⸱

مارس 6, 2009

 ,  ,  , 
1Tetramer Core Laboratory, Benaroya Research Institute, 2Kwok Laboratory, Benaroya Research Institute, 3Nepom Laboratory, Benaroya Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا الإجراء يدل على تنقية والتوسع في المختبر من خلايا CD4 + محددة مستضد الخلايا التائية من الدم المحيطي كله والتصور وذلك باستخدام MHC tetramers الطبقة الثانية Tetramers تسمح التصور المباشر للخلايا T مع خصوصية واحدة ومحددة مستضد MHC تقييد الدرجة الثانية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC) من الدرجة الثانية tetramers سماح التصور المباشر لمستضد معين CD4 + الخلايا التائية التي التدفق الخلوي. هذا الأسلوب يعتمد على التفاعل بين الببتيد محددة للغاية ومحملة MHC المقابلة مستقبلات الخلايا تي. في حين أن تقارب من جزيء MHC / الببتيد واحدة منخفضة ، عبر ربط مجمعات MHC / الببتيد مع streptavidin يزيد الطمع من التفاعل ، مما يتيح استخدامها في تلوين الكواشف. بسبب الترددات المنخفضة نسبيا من خلايا CD4 + T (~ 1 في 300000 لخصوصية واحدة) هذا الاختبار يستخدم لتضخيم المختبر في خطوة لزيادة عتبة الخمسين من الكشف. وتنقيته من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى التي تقوم عليها Ficoll. ثم يتم فصل خلايا CD4 + عن طريق الانتقاء السلبي باستخدام biotinylated كوكتيل الأجسام المضادة والمعادية للالبيوتين المسمى الخرز المغناطيسي. استخدام خلايا ملتصق من الكسر خلايا CD4 كما مستضد تقديم الخلايا ، CD4 + T يتم توسيع الخلايا في وسائل الإعلام عن طريق إضافة الببتيد مستضدي وايل - 2. هي ملطخة الخلايا موسعة مع tetramer الدرجة الثانية المقابلة التي يحتضنها عند 37 مئوية لمدة ساعة واحدة وملون في وقت لاحق باستخدام الأجسام المضادة السطحية مثل CD4 المضادة ، ومكافحة CD3 ، ومكافحة CD25. بعد وضع العلامات ، ويمكن تحليل الخلايا مباشرة من التدفق الخلوي. الخلايا tetramer شكل إيجابي عادة سكانية متميزة بين CD4 + توسيع الخلايا. خلايا Tetramer ايجابية وعادة ما تكون CD25 + CD4 ، وارتفاع في أغلب الأحيان. لأن مستوى تلطيخ tetramer الخلفية يمكن أن تختلف ، ينبغي دائما أن تكون النتائج ايجابية تلطيخ مقارنة تلطيخ الخلايا نفسها مع tetramer غير ذي صلة. اختلافات متعددة من هذا الاختبار الأساسية ممكنة. ويمكن فرز الخلايا Tetramer إيجابية لمزيد من التحليل المظهري ، أو إدراجها في ELISPOT المقايسات انتشار الأسلحة النووية ، أو فحوصات ثانوية أخرى. وقد أثبتت عدة مجموعات كما شارك في تلطيخ tetramers به ​​وإما لمكافحة خلوى أو أضداد FoxP3.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الدم الطرفية وحيدة النواة الخلية (PBMC) العزلة

  1. الحصول على عينة من الدم -- وينبغي جمع الدم في المحاقن أو أنابيب الدم والمضادة للمتخثر مع الهيبارين (1:50 نسبة) لمنع تخثر الدم. توقع محصول بلغ نحو 1 × 10 6 PBMC لكل مليلتر من الدم -- حوالي 40 ٪ منها ستكون إيجابية CD4 (CD4 +) الخلايا التائية.
  2. قسامة الدم في أنابيب مخروطية 50 مل و 25 مل في أنبوب. إذا انفصل الدم ، مزيج بلطف قبل aliquoting لتوزيع البلازما
  3. إضافة برنامج تلفزيوني ، ليصل إج....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فهم دور خلايا CD4 + T في الحصانة من المهم بشكل أساسي. ومع ذلك ، يمكن CD4 + محددة مستضد الخلايا التائية يكون من الصعب اكتشاف وعزل باستخدام الطرق التقليدية. في المقابل ، MHC الدرجة الثانية tetramers سماح التصور المباشر لخلايا CD4 + T مع خصوصية المستضد المطلوب. هذا الفيديو يدل على العزلة ، والتنقية ، والتضخيم في المختبر من خلايا CD4 + T والتصور لاحقا باستخدام tetramers. الفئة الثانية هي Tetramers بروتين فلوري تقارن تتكون من ذوبان الطبقة الثانية biotinylated α / β dimers مترافق حول نو.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ديك فولي وكيمبال لي لدورهم الرئيسي في تصوير وإنتاج أشرطة الفيديو.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خزانة السلامة الحيوية ذات التدفق الطبقي من الفئة 2معداتشركة ثيرمو فيشر ساينتيفيك، إنك.1200أو ما يعادلها
أنبوب مخروطي بسعة 50 ملمعداتVWR الدولي47747-182أو ما يعادلها
1X PBS (خالي من الكاليديوم/مغنيسيوم)الكاشفهايكلونSH30028.02أو ما يعادلها
Ficoll-paque PLUSالكاشفجنرال إلكتريك للرعاية الصحية17-1440-03لف بورق الألمنيوم للحماية من الضوء
خبرة مساعدة البيبيتمعداتدروموند ساينتفيك4-000-101أو ما يعادلها
ماصة 10 ملمعداتكورنينجCLS4492أو ما يعادلها
عبوات إيروسولفمعداتشركة بيكمان كولتر359481مع إدخالات بسعة 50 مل
الطرد المركزيمعداتشركة بيكمان كولترGS-6Rأو ما يعادلها
ماصات النقل معداتسامكو ساينتفيك، ثيرمو فيشر ساينتيفيك202-202أو ما يعادلها
ماصات باستورمعداتVWR الدولي14672-200أو ما يعادلها
المخزن الهيموليزيالكاشفلا يوجدلا يوجد8.3 جرام/لتر NH4Cl، 1.0 جرام/لتر NaHCO3، 0.04 جرام/لتر ثنائي الصوديوم EDTA
تريبان بلوالكاشفسيغما-ألدرتشT61460.2٪ في PBS
مقياس الدممعداتVWR الدولي15170-208
أنبوب مخروطي بحجم 15 ملمعداتVWR الدولي05-527-90أو ما يعادلها
المخزن المؤقت الجاريالكاشفلا يوجدلا يوجدPBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
مجموعة عزل الخلايا T من MACS CD4+ IIالكاشفميلتيني بيوتيك130-091-155أو ما يعادلها
إيزي سيبر® مغناطيسمعداتتقنيات الخلايا الجذعية18000
أنبوب بولي بروبيلين بسعة 5 ملمعداتفالكون بي دي352063
RPMI 1640الكاشفإنفيتروجين22400-089مع HEPES بسعة 25 مللي مولار
مصل بشري مجمعالكاشفلا يوجدلا يوجدتم اختياره من متبرعين أصحاء، تم تعطيل الحرارة وتصفيتها
التهاب العقدي للقلمالكاشفإنفيتروجين1570-063أو ما يعادلها
فلتر زجاجة 500 مل بحجم 0.22 ميكرونمعداتنالجي نونك الدولي595-3320أو ما يعادلها
صفيحة ذات 48 بئرمعداتCostar3548أو ما يعادلها
37° حاضنة CO2 CمعداتسانيوMCO-18AICأو ما يعادلها
ببتيد صناعي 20 ملغ/ملالكاشفلا يوجدلا يوجدتركيب مخصص من أي بائع ببتيدات
أنبوب FACS بسعة 5 ملمعداتفالكون بي دي352008البوليستيرين
رباعي الفئة الثانية المحمل بتيد (كما هو موضح)الكاشفلا يوجدلا يوجدأعد بواسطة نواة رباعي الحزام والطريق
Anti-CD3الكاشفبكالوريوس العلوم الحيوية347344أو ما يعادلها
Anti-CD4الكاشفالعلوم الحيوية الإلكترونية17-0049-73أو ما يعادلها
ضد CD25الكاشفالعلوم الحيوية الإلكترونية11-0259-73أو ما يعادلها
جهاز قياس تدفق Facs Caliburمعداتبكالوريوس العلوم الحيوية342975أو ما يعادلها

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
  2. Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD4

مقالات ذات صلة