هذا الإجراء يدل على تنقية والتوسع في المختبر من خلايا CD4 + محددة مستضد الخلايا التائية من الدم المحيطي كله والتصور وذلك باستخدام MHC tetramers الطبقة الثانية Tetramers تسمح التصور المباشر للخلايا T مع خصوصية واحدة ومحددة مستضد MHC تقييد الدرجة الثانية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المستضد CD4 + تصور معين باستخدام خلايا T MHC الدرجة الثانية Tetramers
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC) من الدرجة الثانية tetramers سماح التصور المباشر لمستضد معين CD4 + الخلايا التائية التي التدفق الخلوي. هذا الأسلوب يعتمد على التفاعل بين الببتيد محددة للغاية ومحملة MHC المقابلة مستقبلات الخلايا تي. في حين أن تقارب من جزيء MHC / الببتيد واحدة منخفضة ، عبر ربط مجمعات MHC / الببتيد مع streptavidin يزيد الطمع من التفاعل ، مما يتيح استخدامها في تلوين الكواشف. بسبب الترددات المنخفضة نسبيا من خلايا CD4 + T (~ 1 في 300000 لخصوصية واحدة) هذا الاختبار يستخدم لتضخيم المختبر في خطوة لزيادة عتبة الخمسين من الكشف. وتنقيته من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى التي تقوم عليها Ficoll. ثم يتم فصل خلايا CD4 + عن طريق الانتقاء السلبي باستخدام biotinylated كوكتيل الأجسام المضادة والمعادية للالبيوتين المسمى الخرز المغناطيسي. استخدام خلايا ملتصق من الكسر خلايا CD4 كما مستضد تقديم الخلايا ، CD4 + T يتم توسيع الخلايا في وسائل الإعلام عن طريق إضافة الببتيد مستضدي وايل - 2. هي ملطخة الخلايا موسعة مع tetramer الدرجة الثانية المقابلة التي يحتضنها عند 37 مئوية لمدة ساعة واحدة وملون في وقت لاحق باستخدام الأجسام المضادة السطحية مثل CD4 المضادة ، ومكافحة CD3 ، ومكافحة CD25. بعد وضع العلامات ، ويمكن تحليل الخلايا مباشرة من التدفق الخلوي. الخلايا tetramer شكل إيجابي عادة سكانية متميزة بين CD4 + توسيع الخلايا. خلايا Tetramer ايجابية وعادة ما تكون CD25 + CD4 ، وارتفاع في أغلب الأحيان. لأن مستوى تلطيخ tetramer الخلفية يمكن أن تختلف ، ينبغي دائما أن تكون النتائج ايجابية تلطيخ مقارنة تلطيخ الخلايا نفسها مع tetramer غير ذي صلة. اختلافات متعددة من هذا الاختبار الأساسية ممكنة. ويمكن فرز الخلايا Tetramer إيجابية لمزيد من التحليل المظهري ، أو إدراجها في ELISPOT المقايسات انتشار الأسلحة النووية ، أو فحوصات ثانوية أخرى. وقد أثبتت عدة مجموعات كما شارك في تلطيخ tetramers به وإما لمكافحة خلوى أو أضداد FoxP3.
البروتوكول
1. الدم الطرفية وحيدة النواة الخلية (PBMC) العزلة
- الحصول على عينة من الدم -- وينبغي جمع الدم في المحاقن أو أنابيب الدم والمضادة للمتخثر مع الهيبارين (1:50 نسبة) لمنع تخثر الدم. توقع محصول بلغ نحو 1 × 10 6 PBMC لكل مليلتر من الدم -- حوالي 40 ٪ منها ستكون إيجابية CD4 (CD4 +) الخلايا التائية.
- قسامة الدم في أنابيب مخروطية 50 مل و 25 مل في أنبوب. إذا انفصل الدم ، مزيج بلطف قبل aliquoting لتوزيع البلازما
- إضافة برنامج تلفزيوني ، ليصل إج....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
فهم دور خلايا CD4 + T في الحصانة من المهم بشكل أساسي. ومع ذلك ، يمكن CD4 + محددة مستضد الخلايا التائية يكون من الصعب اكتشاف وعزل باستخدام الطرق التقليدية. في المقابل ، MHC الدرجة الثانية tetramers سماح التصور المباشر لخلايا CD4 + T مع خصوصية المستضد المطلوب. هذا الفيديو يدل على العزلة ، والتنقية ، والتضخيم في المختبر من خلايا CD4 + T والتصور لاحقا باستخدام tetramers. الفئة الثانية هي Tetramers بروتين فلوري تقارن تتكون من ذوبان الطبقة الثانية biotinylated α / β dimers مترافق حول نو.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
نشكر ديك فولي وكيمبال لي لدورهم الرئيسي في تصوير وإنتاج أشرطة الفيديو.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| كابينة السلامة الحيوية بتدفق صفائحي من الفئة 2 | معدة | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 1200 | أو ما يعادلها |
| أنبوب مخروطي سعة 50 mL | معدة | VWR international | 47747-182 | أو ما يعادلها |
| 1X PBS (خالٍ من Ca/Mg) | كاشف | Hyclone | SH30028.02 | أو ما يعادلها |
| Ficoll-paque PLUS | كاشف | GE Healthcare | 17-1440-03 | مغلف بورق ألومنيوم للحماية من الضوء |
| مساعد ماصة Pipet Aid XP | معدة | Drummond Scientific | 4-000-101 | أو ما يعادلها |
| ماصة سعة 10 mL | معدة | Corning | CLS4492 | أو ما يعادلها |
| عبوات Aerosolve | معدة | Beckman Coulter Inc. | 359481 | مع حشوات سعة 50 mL |
| جهاز طرد مركزي | معدة | Beckman Coulter Inc. | GS-6R | أو ما يعادلها |
| ماصات نقل | معدة | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 202-20S | أو ما يعادلها |
| ماصات باستور | معدة | VWR international | 14672-200 | أو ما يعادلها |
| محلول منظم لتحلل الدم | كاشف | N/A | N/A | 8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA |
| صبغة تريبان الزرقاء | كاشف | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.2% في PBS |
| مقياس كرات الدم (Hemocytometer) | معدة | VWR international | 15170-208 | |
| أنبوب مخروطي سعة 15 mL | معدة | VWR international | 05-527-90 | أو ما يعادلها |
| المحلول المنظم للتشغيل | كاشف | N/A | N/A | PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA |
| طقم عزل خلايا T CD4+ MACS II | كاشف | Miltenyi Biotec | 130-091-155 | أو ما يعادلها |
| مغناطيس EasySep® | معدة | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| أنبوب بولي بروبيلين سعة 5 mL | معدة | Falcon BD | 352063 | |
| RPMI 1640 | كاشف | Invitrogen | 22400-089 | مع 25 mM HEPES |
| مصل بشري مجمع | كاشف | N/A | N/A | مسحوب من متبرعين أصحاء، ومثبط حرارياً ومفلتر |
| Pen Strep | كاشف | Invitrogen | 1570-063 | أو ما يعادلها |
| مرشح علوي للزجاجات سعة 500mL بمسامية 0.22 ميكرون | معدة | Nalge Nunc international | 595-3320 | أو ما يعادلها |
| صفيحة ذات 48 بئراً | معدة | Costar | 3548 | أو ما يعادلها |
| حضّانة 37°C CO2 | معدة | Sanyo | MCO-18AIC | أو ما يعادلها |
| ببتيد اصطناعي بتركيز 20 mg/mL | كاشف | N/A | N/A | تخليق مخصص من أي مورد ببتيدات |
| أنبوب FACS سعة 5 mL | معدة | Falcon BD | 352008 | بولي ستيرين |
| رباعي القسيمات (tetramer) من الفئة الثانية محمل بالببتيد (كما هو موصوف) | كاشف | N/A | N/A | تم تحضيره بواسطة مركز رباعيات القسيمات BRI |
| Anti-CD3 | كاشف | BD Biosciences | 347344 | أو ما يعادلها |
| Anti-CD4 | كاشف | eBioscience | 17-0049-73 | أو ما يعادلها |
| Anti-CD25 | كاشف | eBioscience | 11-0259-73 | أو ما يعادلها |
| جهاز قياس التدفق الخلوي Facs Calibur | معدة | BD Biosciences | 342975 | أو ما يعادلها |
المراجع
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers permit detection and characterization of peptide-specific human CD4+ T cells proliferating to influenza A antigen. J. Clin. Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Gebe, J. A., Falk, B., Nepom, G. T., Falk, B., Koelle, D. M., Kwok, W. W.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
