وصفنا بروتوكول بسيطة لتحديد البروتينات التي تربط الدماغ إلى نهاية طول C الكامل لمستقبلات P2X2 ATP بوابات. ومن المتوقع التمديد والتطبيق المنهجي لهذه الطريقة لجميع المستقبلات P2X أن تؤدي إلى فهم أفضل للإشارات مستقبلات P2X.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
البروتيوميات من التعرف على البروتينات التفاعل مع P2X2 قنوات الكاتيون يجند بوابات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
القنوات الأيونية يجند بوابات الاتصالات متشابك تكمن في الجهاز العصبي 1. في الثدييات وجود ثلاث عائلات من يجند بوابات قنوات : حلقة السيستئين ، والغلوتامات بوابات ومستقبلات القنوات P2X 2. في كل حالة من الارسال ملزم يؤدي إلى فتح المسام التي من خلالها تتدفق أيونات لها الكهروكيميائية التدرجات. كثير من يجند بوابات قنوات هي أيضا نفاذا إلى أيونات الكالسيوم 3 ، 4 ، مما يشير الى المصب الأدوار 5 (على سبيل المثال تنظيم الجينات) التي قد تتجاوز مدة فتح القناة. وبالتالي يمكن أن يجند بوابات قنوات الإشارات عبر جداول زمنية واسعة النطاق من الألف إلى بضعة أيام. قد تعطى هذه الأدوار الهامة التي لا بد أن نفهم كيف يجند بوابات قنوات ايون تنظم نفسها من البروتينات ، وكيف أن هذه البروتينات توليف الإشارة. الدراسات الحديثة تشير إلى أن الكثير ، إن لم يكن كلها ، القنوات قد تكون جزءا من مجمعات البروتين يشير 6. في هذه المقالة نوضح كيفية التعرف على البروتينات التي ترتبط الجوانب C - محطة المجال مستقبلات P2X2 عصاري خلوي.
مستقبلات P2X قنوات الكاتيون ATP - بوابات وتتألف من سبع مفارز (P2X1 - P2X7). وأعرب على نطاق واسع مستقبلات P2X في الدماغ ، حيث توسط انتقال متشابك مثير وتيسير الإفراج قبل المشبكي العصبي 7. تم العثور على المستقبلات في الخلايا P2X منفعل وغير منفعل ، والتوسط في أدوار رئيسية في إشارات العصبية ، والتهاب القلب والأوعية الدموية ووظيفتها 8. P2X2 المستقبلات وفيرة في النظام العصبي 9 و هي محور هذه الدراسة. ويعتقد أن كل الوحيدات P2X لامتلاك شرائح غشاء two الممتدة (TM1 وTM2) مفصولة المنطقة خارج الخلية (7) وبين الخلايا وC N مصطلحات (الشكل 1A) 7. مفارز P2X 10 (P2X1 - P2X7) إظهار تسلسل تناظر ما بين 30-50 ٪ على مستوى الحمض الأميني 11. مستقبلات P2X تحتوي سوى ثلاث مفارز ، الذي هو أبسط رياضيات الكيمياء بين المستقبلات ionotropic. وP2X2 C - يتكون من 120 محطة الأحماض الأمينية (الشكل 1B) ويحتوي على عدة مواقع لرسو السفن الآراء البروتين ، ودعم الفرضية القائلة بأن P2X2 مستقبلات قد تكون جزءا من مجمعات الإشارة. لكن ، على الرغم من ونسبت عدة وظائف للمحطة - C من المستقبلات P2X2 9 وقد وصفت أية دراسة الشركاء الجزيئية التي الزوجان إلى الجانب هذا البروتين داخل الخلية عبر كامل طول C - محطة. في هذه الورقة أساليب وصفنا نهج البروتين لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع كامل طول C - محطة P2X2 من المستقبلات.
البروتوكول
إجراءات تجريبية
الإجراء التجريبي (الشكل 2) ويتكون من أربعة أجزاء التي تم وصفها على نحو تدريجي أدناه.
الجزء 1 : Subcloning والتعبير من محطة سي P2X2 من المستقبلات.
لقد أعربنا عن طول كامل من محطة C - P2X2 المستقبلات في البكتيريا لتحديد بروتينات الدماغ الذي يربط.
- وكان تضخيم C - محطة (مخلفات 353-472) من مستقبلات P2X2 (الشكل رقم 1) بواسطة PCR ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
القنوات الأيونية هي فئة كبيرة من البروتينات الغشاء لا يتجزأ منها. أنها تحتوي على المياه تملأ المسام التي تسمح بشكل انتقائي حركة الأيونات أسفل التدرجات الكهروكيميائية بهم عبر غشاء البلازما. أيون قنوات مفتوحة بين البوابة ودول مغلقة. يتم تشغيل الخطوة المعزولة بواسطة أجهزة الإرسال (مثل ATP) في حالة وجود قنوات يجند P2X ايون مسور ، أو قد يتم تنظيمها من قبل تفاعلات مع بروتينات أخرى. لقد شهد العقد الماضي زيادة في فهمنا لكيفية ربط المستقبلات P2X ATP 13 ، لكن دور البروتينات المسا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
SW ومعتمدة من قبل TMV NCRR وNHLBI في المعاهد الوطنية للصحة. BSK معتمدة من قبل وHS NINDS وNIGMS من المعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| أسيتونيتريل | كاشف | JT Baker | 9829-02 | |
| أكريلاميد | كاشف | Bio-Rad | 161-0156 | |
| أمبيسيلين | كاشف | VWR international | VW1507-01 | |
| بيكربونات الأمونيوم | كاشف | Fluka | 09830 | |
| بيرسلفات الأمونيوم (APS) | كاشف | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) | كاشف | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| كاشف برادفورد | كاشف | Bio-Rad | 500-0006 | |
| بروموفينول بلو | كاشف | Fisher Scientific | B-392 | |
| كوكماسي الأزرق R-250 | كاشف | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-24972 | |
| ديثيوثريتول (DTT) | كاشف | EMD Millipore | 3860 | |
| حمض إيثيلين ثنائي الأمين رباعي حمض الأسيتيك (EDTA) | كاشف | VWR international | VW1474-01 | |
| حمض إيثيلين جليكول رباعي حمض الخليك (EGTA) | كاشف | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| حمض الفورميك | كاشف | EMD Millipore | 11670-1 | |
| حبيبات جلوتاثيون سيفاروز 4B (Glutathione Sepharose 4B beads) | كاشف | GE Healthcare | 17-5132-01 | |
| حمض الهيدروكلوريك (HCl) | كاشف | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| إيزوبروبيل-بيتا-دي-ثيوجالاكتوبيرانوسيد (IPTG) | كاشف | Sigma-Aldrich | 15502 | |
| يودوأسيتاميد | كاشف | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| وسط لوريا-برتاني (LB) الغذائي | كاشف | EMD Millipore | 1.00547.5007 | |
| ليوبيبتين | كاشف | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| ليزوزيم | كاشف | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| كبريتات المغنيسيوم (MgSO₄)4) | كاشف | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| كلوريد الصوديوم (NaCl) | كاشف | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| فلوريد الصوديوم (NaF) | كاشف | Sigma-Aldrich | S7920 | |
| أورثوفانادات الصوديوم (Na3تعليق صوتي4) | كاشف | Sigma-Aldrich | S6508 | |
| نونيديت P40 (Nonidet P40) | كاشف | Fluka | 74385 | |
| فينيل ميثان سلفونيل فلوريد (PMSF) | كاشف | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| قرص مثبط البروتياز | كاشف | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| معيار البروتين | كاشف | Bio-Rad | 161-0305 | |
| ساركوسيل | كاشف | Acros Organics | 61207 | |
| قارورة ذات غطاء لولبي | أداة | Agilent Technologies | 5182-0866 | |
| دوديسيل كبريتات الصوديوم | كاشف | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| SYPRO® صبغة روبي لبروتينات الهلام | كاشف | Bio-Rad | 170-3125 | |
| ن، ن، ن’،ن’تتراميثيل إيثيلين ديامين (TEMED) | كاشف | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| تريس قاعدة (Tris base) | كاشف | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | كاشف | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| تريپسين | كاشف | Promega Corp. | V5111 | |
| Tween 20 | كاشف | Sigma-Aldrich | P5927 | |
| الماء | كاشف | بيرديك &جاكسون | 365-4 | |
| مقياس طيف الكتلة الترادفي LTQ-Orbitrap | أداة | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| نظام الكروماتوغرافيا السائلة النانوية | أداة | إكسيجنت | ||
| ب-مركابتوهيدروإيثانول–إيثانول | كاشف | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| جليسرول | EMD Millipore | GX0185-6 |
المراجع
- Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).
- Khakh, B. S. Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses. Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contr....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
