الاشتقاق السلائف ظهاري من الخلايا الجنينية (ES) الجذعية باستخدام خلايا انسجة النشاط يحفز المشتقة (SDIA).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ES الخلية المستمدة من الثقافات خلية عصبية ظهارية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ES الخلايا لديها القدرة على التمايز إلى خلايا من كل الطبقات الجرثومية ، مما يجعلها أداة جذابة لتطوير علاجات جديدة. بشكل عام ، والتفريق بين الخلايا وفاق يتبع مفهوم لتوليد first الخلايا الاصلية غير ناضجة ، والتي يمكن بعد ذلك نشر ومتمايزة في الظواهر الخلوية ناضجة. وهذا ينطبق أيضا على تكوين الخلايا العصبية المشتقة من خلية وفاق ، والذي تطور من الخلايا العصبية يلي خطوتين رئيسيتين : الأولى ، والاشتقاق والتوسع السلائف ظهاري غير ناضجة والثانية ، والتمايز في الخلايا العصبية الخاصة ناضجة. ويستند أسلوب مشترك لإنتاج خلايا عصبية من الأسلاف وفاق بشأن تشكيل مضغي الشكل (EB) الجسم ، والذي يكشف عن تمايز الخلايا من جميع الطبقات بما في ذلك جرثومة neuroectoderm. طريقة بديلة وأكثر فعالية لتحفيز نمو الخلايا الظهارية العصبية يستخدم انسجة النشاط يحفز الخلايا المشتقة من (SDIA) ، والذي يمكن تحقيقه من خلال خلايا ES شارك في زراعة نخاع مع عظم الجمجمة المستمدة من الخلايا اللحمية (1). كل من تشكيل المجلس التنفيذي ، وSDIA ، تكشف عن تطوير هياكل شبيهة ريدة ، التي يعتقد أنها تشبه الأنبوب العصبي و / أو العصبية الأسلاف قمة شبيهة. ويمكن عزل السلائف العصبية وتوسيعه وبتقسيمها الى الخلايا العصبية والخلايا الدبقية محددة باستخدام شروط ثقافة محددة. هنا ، نحن تصف الجيل وريدات عزل هذه الثقافة في المشاركة في التجارب مع خط الخلية اللحمية MS5 (2-5).
البروتوكول
الخطوة 1
- لوحة mitomycin - C - ggrowth تحول دون (10 ميكروغرام / مل لمدة 2.5 ساعة) MS5 الخلايا في كثافة CM2 / 70000 على الجيلاتين المغلفة لوحات 6 (0.01 ٪ لمدة 30 دقيقة) جيدا في α - MEM وسائل الإعلام.
- عندما تعلق الخلايا وشكلت أحادي الطبقة (أكثر من النمو ليلة) ، والتحول إلى SRM.
- عزل المستعمرات الخلية يدويا ES من الثقافات الخلية ES باستخدام المحاقن مع 27 ½ G الإبرة.
- Tritrurate المستعمرات بعناية مع طرف زرقاء 1 مل ومنخفض الكثافة في لوحة على خلايا MS5 (عادة 2-3 المستعمرات في لوحة 6 أيضا).
ملاحظة : يمكن أيضا أن خلايا ES تؤخذ من الانتشار الأنزيمية باستخدام كولاجيناز أو التربسين.
الخطوة 2
- تنمو الخلايا ES على مغذيات MS5 لمدة 14-21 يوما ، الى حين تشكيل المستعمرات التي تحتوي على ريدة.
ملاحظة : تغيير وسائل الإعلام في كثير من الأحيان. وريدات وعادة ما تكون على الحواف الخارجية للمستعمرات ، ويمكن تشكيلها تتعزز بشكل كبير إذا تم إضافة 300-500 نانوغرام / مل رأس لSRM (3). تمايز في بعض البروتوكولات ، ويمكن تبادلها مع SRM A - N2 وسائل الإعلام وتستكمل مع النمو أو العوامل الأخرى لتعزيز مواصفات الخلية (2-5).
الخطوة 3
- عزل وانتقاء ريدات مع 27 تحت المجهر G ½ الإبرة.
ملاحظة : تجنب القطع واختيار الخلايا اللحمية MS5. إذا كانت معبأة المستعمرات مع ريدات ، يمكن للمرء أيضا عزل المستعمرة برمتها.
الخطوة 4
- نضح في مجموعات من ريدات ، tritrurate بعناية مع طرف 1 مل الأزرق ، ومنها على لوحة بولي - L - الأورنيثين (0.001 ٪) وفبرونيكتين (1 ميكروغرام / مل) أو laminin (1 ميكروغرام / مل) المغلفة 6 آبار في N2 - A تستكمل وسائل الاعلام عادة مع bFGF (20 نانوغرام / مل). فإن إصلاح وتوسيع الوريدات.
ملاحظة : تعزيز بقاء الخلية ، ويمكن للمرء أن بليت في مجموعات صغيرة لزيادة الكثافة قطرات الخلية. ويمكن أيضا أن يتم تعديل هذه الخطوة من خلال استكمال N2 - A وسائل الاعلام مع نمو إضافية أو العوامل الأخرى لتعزيز مواصفات الخلية (2-5).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول يوضح الخطوات المختلفة في توليد وعزل الخلايا الظهارية العصبية من الخلايا البشرية وفاق به SDIA. تطبيق هذا الأسلوب متعدد الجوانب واستخدمت في العديد من البروتوكولات لإنتاج خلايا عصبية معينة (مثلا 1 ، 2 ، 5-9). ويعتقد أن ريدات تشبه الخلايا العصبية أنبوب مع النمط الظاهري الأمامي (2 ، 5 ، 10) ، وتحتوي أيضا على قمة الأسلاف العصبية (11 ، 12). بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تحتفظ مستوى معين من المرونة ، حيث يمكن منقوشة من قبل عوامل محددة في ظروف محددة الثقافة. وبالتالي ، يمكن للأسلاف SDIA المستمدة من ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | ||
| alpha-MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12571 | ||
| البنسلين/ستريبتومايسين | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | ||
| Knockout-DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 10829 | ||
| بديل المصل Knockout | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | ||
| محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM | GIBCO, by Life Technologies | 12383 | ||
| DMEM/F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | ||
| مكمل N2-A | Stem Cell Technologies | 07152 | ||
| Mitomycin-C | Sigma-Aldrich | M0503 | ||
| جيلاتين من النوع A | Sigma-Aldrich | G1890 | ||
| poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | محلول بتركيز 0.01% | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L-2020 | ||
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F2006 | ||
| عامل نمو الأرومات الليفية الأساسي (bFGF) | Invitrogen | 13256 | ||
| حقنة سعة 1 mL مع إبرة قياس 27 1/2 G | BD Biosciences | 309623 | ||
| وسط N2-A | وسط | DMEM/F12 + 1% مكمل N2-A | ||
| وسط بديل المصل (SRM) | وسط | Knockout-DMEM + 20% بديل المصل Knockout + 1% محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM + 2 mM L-glutamine | ||
| وسط α-MEM | وسط | α-MEM + 10% FBS + 2 mM L-glutamine + 1% بنسلين/ستريبتومايسين | ||
| MS5 | خط خلوي | خلايا سدوية | ||
| مجهر | ||||
| أطباق ذات 6 آبار | للاستزراع النسيجي |
المراجع
- Kawasaki, H., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Perrier, A. L., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 12543-12548 (2004).
- Pruszak, J., Isacson, O., Sullivan, S., Cowan, C., Eggan, K. Directed differentiation of human embryonic stem cells into dopaminergic neurons. Human Embryonic Stem Cells: The Practical Handbook. , (2007).
- Pruszak, J., Sonntag, K. C., Aung, M. H., Sanchez-Pernaute, R., Isacson, O. Markers and methods for cell sorting of human embryonic stem cell-derived neural cell populations. Stem Cells. 25, 2257-2268 (2007).
- Sonntag, K. C., et al. Enhanced yield of neuroepithelial precursors and midbrain-like dopaminergic neurons from human embryonic stem cells using the bone morphogenic protein antagonist noggin. Stem Cells. 25, 411-418 (2007).
- Kawasaki, H., et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1580-1585 (2002).
- Ko, J. Y., et al. Human embryonic stem cell-derived neural precursors as a continuous, stable, and on-demand source for human dopamine neurons. J Neurochem. 103, 1417-1429 (2007).
- Hong, S., Kang, U. J., Isacson, O., Kim, K. S. Neural precursors derived from human embryonic stem cells maintain long-term proliferation without losing the potential to differentiate into all three neural lineages, including dopaminergic neurons. J Neurochem. , (2007).
- Zhang, S. C. Neural subtype specification from embryonic stem cells. Brain Pathol. 16, 132-142 (2006).
- Pankratz, M. T., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Lazzari, G., et al. Direct derivation of neural rosettes from cloned bovine blastocysts: a model of early neurulation events and neural crest specification in vitro. Stem Cells. 24, 2514-2521 (2006).
- Pomp, O., Brokhman, I., Ben-Dor, I., Reubinoff, B., Goldstein, R. S. Generation of peripheral sensory and sympathetic neurons and neural crest cells from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 923-930 (2005).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
