ظهارة الأذن الداخلية الحسية من الزرد هو نظام أخلاقي نموذجا جيدا لفهم آليات تجديد خلايا الشعر في الفقاريات الكبار. هذا البروتوكول يوضح تشريح غرامة من ظهائر ، التي نستطيع من خلالها الحصول على عينات الأنسجة لدراسة الأحداث على المستويات التجدد الخلوي والتحت خلوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الجسيمة والجميلة تشريح الأذن الداخلية الظهارة الحسية في اسماك الزرد الكبار ( دانيو rerio)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ظهائر العصبي الحسي في الأذن الداخلية هي حاسمة بالنسبة لهياكل وظائف السمع والتوازن. لذا ، فمن المهم أن نفهم ملامح الخلوية والجزيئية للظهائر ، والتي تتكون أساسا من نوعين من الخلايا : خلايا الشعر (الهيدروجيني) والخلايا المساندة (SCS). هنا نختار لدراسة ظهائر الأذن الداخلية الحسية في الزرد الكبار ، ليس فقط لأنه يتم حفظها عاليا هياكل الظهارية في جميع الفقاريات التي تمت دراستها ، ولكن أيضا لأن الزرد أخلاقي قادر على التجدد الهيدروجيني ، قدرة أن الثدييات تفقد بعد فترة قصيرة من الولادة. نستخدم الأذن الداخلية من الزرد الكبار ونظام نموذجي لدراسة آليات التجديد HC الداخلية الأذن في الفقاريات الكبار التي يمكن أن تكون مفيدة لعلاج السمع السريرية / العجز في ميزان الإنسان نتيجة لفقدان HC.
نحن هنا لشرح كيفية القيام بتشريح الجسيمة وغرامة قدرها ظهائر الأذن الداخلية الحسية في الزرد الكبار. تشريح الإجمالي إزالة الأنسجة المحيطة الأذن الداخلية ومفيد لإعداد أقسام الأنسجة ، والذي يتيح لنا أن دراسة هيكل تفصيلي للظهائر الحسية. تشريح غرامة ينظف أنسجة غير حسية الظهارية كل ظهارة الفردية وتمكننا من دراسة التباين في ظهارة كله بسهولة في كل جبل عينات بشرية.
البروتوكول
الجزء 1 : إعداد النسيج
- الموت ببطء والزرد مع الكبار مخزنة MS - 222 (3 الأثيل أمينوبنزوات الملح methanesulfonate ، 0.03 ٪).
- قطع رأس السمكة. قطع الفك السفلي ، ضع الرأس على منصة التشريح مع الجانب البطنية يصل ، ويشل النسيج مع دبابيس الحشرات. إزالة الأنسجة اللينة بطني في الجمجمة وكسر فتح جزء من بطني الكبسولة الجمجمة مع زوج من ملاقط غرامة تشريح تحت المجهر.
- حل رئيس الأسماك في بارافورمالدهيد (4 ٪) في 4 درجات مئوية خلال الليل.
- شطف الرأس الأسماك ثابتة في برنامج تلفزيوني (الفوسفات التخزين المؤقت المالحة ، 1X) لمدة 3 مرات ، 5 دقائق في كل مرة.
الجزء 2 : تشريح الإجمالي في الأذن الداخلية
- وضع رئيس الأسماك على منصة التشريح حتى مع الجانب البطني. شل مع دبابيس الحشرات. تتم جميع الخطوات التالية تحت مجهر تشريح.
- مع زوج من ملاقط غرامة ، وإزالة العظم الجمجمة فوق الأذن الداخلية ومن ثم سحب بعناية أنسجة الأذن الداخلية : الكييسات ، lagenae وutricles. والكييس lagena ويتم إرفاق بإحكام مع بعضها البعض ، وبالتالي سحب معا بينما utricle (الأمامي إلى الكييس وlagena) ، ومن المرجح جدا أن تكون منفصلة عن أجهزة الطرف الآخر أثناء تشريح.
- وضع أنسجة الأذن الداخلية في برنامج تلفزيوني (1X). اذا كانت هناك حاجة أي تشريح مزيد غرامة ، وشطف الأنسجة 2-3 مرات مع برنامج تلفزيوني (1X) ويمكن استخدامه لتجارب أخرى ، مثل cryosections.
الجزء 3 : تشريح الجميلة من ظهائر الأذن الداخلية الحسية
- ويمكن إجراء تشريح غرامة في قطرة من برنامج تلفزيوني (1X) على شريحة زجاجية نظيفة.
- إزالة otolith القريبي من utricle مع اثنين من أزواج من ملاقط دقيقة ، وإذا كان المطلوب ، وتقليم قبالة الأنسجة الطلائية غير الحسية وتعصيب للمن ظهائر مع زوج من ملاقط وغرامة شفرة الإبرة.
- إزالة otolith lagenar قبل التفرق والكييس ظهائر lagenar بينما محاولة للحفاظ على الكييس بأسرها سليمة قدر الإمكان. مكان النسيج في برنامج تلفزيوني مع انخفاض يصل الجانب البطني. استخدام إبر شفرة لقطع بعناية في كيس وبين lagena. تقليم قبالة المفرط غير الحسية الأنسجة الطلائية وinnvervation مع ملاقط الجميلة والنصل الإبرة ، وإذا رغبت في ذلك.
الجزء 4 : تلطيخ نيون للخلايا الشعر في ظهائر الحسية
- شطف ظهائر الحسية مع PBT (1XPBS وتريتون 1 ٪ X - 100) لمدة 3 مرات ، 5 دقائق في كل مرة.
- احتضان لظهائر مع fluophore المسمى phalloidin (مثل اليكسا طحين 488 Phalloidin ، 1:1،000 التخفيف) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف ظهائر الحسية مع PBT لمدة 3 مرات و 10 دقيقة في كل مرة.
- تحميل ظهائر على شريحة مع تصاعد المتوسطة والتحقق من النسيج الملون تحت المجهر الفلورسنت مع مرشحات من الطول الموجي المناسب.
- بعد تشريح ناجحة والتلوين ، ويمكن أن ينظر إلى ظهائر سليمة قوية مع ربطة الشعر تلوين الخلية تحت المجهر (الشكل 1).
الشكل 1. تم صبغ الشعر من خلايا ظهارة الحسية الكييس مع Phalloidin اليكسا 488 طحين (الأخضر) ، وكان تشريح عينات الأنسجة والملون على النحو المذكور في هذه الورقة. وقد اتخذت العديد من الصور في مواقع مختلفة من العينة ومزينة بالبلاط مع أدوبي فوتوشوب 7.0.
مقياس شريط = 150μm.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول ، وصفنا تشريح الجسيمة وغرامة من ظهائر الأذن الداخلية الحسية من الزرد الكبار ، والتي تمكننا من تحضير عينات الأنسجة لدراسة الخصائص الخلوية والتحت خلوية من ظهائر الحسية.
من أجل إجراء تشريح ناجحة ، فإن الخطوة الأولى للغاية ، التثبيت ، مهم جدا. تأكد من أن عليك دائما استخدام الطازجة بارافورمالدهيد حل لأن الحل القديمة سيؤدي إلى تثبيت تحت الأنسجة التي يصعب التعامل أثناء تشريح. ومع ذلك ، تأكد من ان كنت ل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث جماعية للمجلس الوطنى لمعهد بحوث الجينوم البشرية والمعاهد الوطنية للصحة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| MS222 (ملح ميثان سلفونات إيثيل 3-أمينوبنزوات) | كاشف | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| PBS (محلول ملحي منظم بالفوسفات، 10X) | كاشف | Mediatech, Inc. | 46-013-CM | |
| بارافورمالدهيد (Paraformaldehyde) | كاشف | Sigma-Aldrich | P-6148 | |
| Triton X-100 | كاشف | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | كاشف | Invitrogen | A12379 | |
| VECTASHIELD Hard Set Mounting Medium with DAPI (وسط تثبيت صلب مع DAPI) | كاشف | Vector Laboratories | H-1500 | |
| مجهر تشريحي | مجهر | Nikon Instruments | SMZ1000 | |
| دبابيس حشرات | أداة | Fine Science Tools | 26000-40 | |
| مقصات | أداة | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
| ملاقط | أداة | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045 | |
| شفرة إبرة | أداة | Sharpoint | 78-6810 | |
| مجهر فلوري | مجهر | Carl Zeiss, Inc. | Axiovert 200M | |
| وسادة تشريح | أداة | eNasco | SB07840M | |
| سمكة الزيبرا (Zebrafish) | حيوان | متنوع | n/a |
إعادة الطباعة والأذونات
