في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة يمكن من خلالها تحليل الدماغ النامي في أجنة الفقاريات الزرد يعيش في قرار خلية واحدة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ويشمل هذا الأسلوب الذي كنا حقن الجنين الزرد وحيدة الخلية وجبل لاحقا وصورة الدماغ النامي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح طريقة مختبرنا وقد وضعت لتحليل التغييرات وإعادة ترتيب شكل الخلية المطلوبة لثني والطي الدماغ الزرد النامية (Gutzman وآخرون ، 2008). مثل هذا التحليل يعطي فهما جديدا للبيولوجيا الخلية الأساسية اللازمة لتطوير البنية 3D الفقاريات من الدماغ ، ويزيد بشكل كبير من قدرتنا على دراسة التشكل أنبوب العصبي. يتشكل الدماغ الزرد الجنينية ابتداء من الساعة 18 التسميد آخر ساعة (HPF) والبطينين داخل الظهارة العصبية تضخيم. بنسبة 24 HPF ، والخطوات الأولية التشكل الأنبوب العصبي كاملة. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا ، يتم حقن الأجنة في مرحلة خلية واحدة مع ترميز الغشاء مرنا استهداف بروتين الفلورية الخضراء (memGFP). HPF بعد الحقن ، والحضانة ، وجنين ، وبين 18 و 24 الآن ، هي التي شنت ، مقلوب ، في agarose والتقط بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. ومن الجدير بالذكر أن الجنين الزرد شفافة مما يجعلها مثالية لنظام التصوير الفلورسنت. في حين ركزت تحليلاتنا على الحدود الدماغ المتوسط ، الدماغ المؤخر والدماغ المؤخر ويمكن تمديد هذه طريقة لتحليل أي منطقة في الزرد إلى عمق 8-10 ميكرون.
البروتوكول
1. إعداد مرنا للحقن
- وكتب على مرنا المستخدمة في هذا الإجراء من ترميز البلازميد CAAX - eGFP (memGFP) مرنا. يصبح خطي لأول مرة وفقا لبلازميد Gutzman آخرون ، 2008.
- ثم نسخ مرنا memGFP باستخدام mMachine mMessage عدة.
- تمييع مرنا مما أدى إلى 1μg/μl ، قسامة ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
- إعداد قالب حقن agarose 1 ٪ مع الممرات عرض الأجنة في مرحلة خلية واحدة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لحقن مرنا في واحد الأجنة الزرد الخلية. هنا ، فإننا نستخدم مرنا ترميز GFP غشاء استهداف لتسمية كل خلية. ثم نظهر كيفية تحميل وصورة الدماغ النامية في قرار خلية واحدة. وقد سمحت لنا هذه التقنية لدراسة نوع جديد من تغيير شكل الخلية ، وانقباض القاعدية ، المطلوبة لتشكيل الحدود الدماغ المتوسط ، الدماغ المؤخر (Gutzman وآخرون ، 2008). تحليل مماثل من الظواهر الأخرى لديها القدرة على التوسع بشكل كبير من فهمنا التشكل الفقاريات وبيولوجيا الخلايا الكامنة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
جزيل الشكر للدكتور جنيفر Gutzman الذين طوروا الاولى من هذا الأسلوب في مختبر SIVE. أيضا بفضل الخضراء JB في بوسطن دانا فاربر معهد السرطان ، MA الذين قدموا يرجى الترميز البلازميد CAAX - GFP مرنا. أجري التصوير مبائر في مرفق WM مؤسسة كيك التصوير البيولوجي في وايتهيد. معتمد من قبل النظام المنسق NIHMH70926. معتمد من قبل المصري الزمالة بعد الدكتوراه قبل جبهة الخلاص الوطني.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| أجاروز SeaKem GTG | كاشف | Lonza Inc. | 50027 | |
| إيثيل إستر حمض 3-أمينوبنزويك (تريكائين) | كاشف | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| أنابيب شعرية | أداة | Frederick Haer and Co. | 30-30-1 | Borosil 1.0mmOD x 0.5mm ID/fiber 100mm |
| شحم سيليكون للتفريغ | كاشف | VWR international | W0S717 | |
| ملقط | أداة | Fine Science Tools | 11232-20 | Dumont #5 Bio Inox |
| رؤوس ماصات 1-200 μl | أداة | USA Scientific, Inc. | 111-0806 | هذه هي الحجم المناسب للأجنة بعمر 24 hpf. |
| طقم نسخ mMessage mMachine | كاشف | Ambion | AM1340 | إنزيم SP6 RNA polymerase |
| مجهر Zeiss LSM 510 الماسح البؤري | مجهر | Carl Zeiss, Inc. | ||
| متحكم دقيق | أداة | Narishige International | ||
| محقن دقيق | أداة | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| جهاز سحب الماصات الدقيقة | أداة | Sutter Instrument Co. |
المراجع
- Gutzman, J. H., Graeden, E., Sive, H. Formation of the zebrafish midbrain-hindbrain boundary constriction requires laminin-dependent basal constriction. Mech Dev. 125 (974), 11-12 (2008).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: a Guide for the Laborat....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
