Method Article

مكتبة كبيرة إدراج الجينوم البيئية الإنتاج

DOI:

10.3791/1387

⸱

September 23rd, 2009

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصف بناء مكتبة fosmid مع الحمض النووي الجيني البيئية معزولة عن عمق التواصل الرأسي لالمضيق البحري ميتة موسميا. يتم اختيار مكتبة استنساخ الناتج إلى 384 لوحات وكذلك المحفوظة في التسلسل الوظيفي المصب والفرز من تطبيق نظام اختيار مستعمرة الآلي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغالبية العظمى من الميكروبات في الطبيعة تبقى غير قابلة للوصول في الوقت الراهن لأساليب الزراعة التقليدية. على مدى العقد الماضي ، والثقافة المستقلة الجينومية البيئية (

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تقسيم المكتبة Fosmid البناء في أربع خطوات رئيسية وفرعية مقسمة إلى عدة أجزاء (انظر Fig.1 لمحة عامة).

الخطوة الأولى (راجع "استخراج الحمض النووي من 0.22 ميكرومتر مرشحات Sterivex" بروتوكول [3])

الجزء 1 : انزيم تحلل الخلايا المحفزة

الجزء 2 : تنقية البيئة عن طريق الحمض النووي CSCL الطرد المركزي المتدرج الكثافة والانتعاش الحمض النووي

الجزء 3 : ضبط الج....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ووصف الإجراء كيفية بأكبر قدر من الكفاءة إنشاء مكتبة واسعة مع إدراج fosmid الحمض النووي الجيني المستمدة من عينة المياه الساحلية. يوصف أعلى المصب استخراج الحمض النووي الجيني في بروتوكول منفصل [3].

حيث بلغ الإنتاج fosmid مكتبة هي متعددة الخطوات ، العملية ، خطة على الأقل أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع في الوقت المناسب لإجراء العملية برمتها بما في ذلك جميع الخطوات الأربع المقدمة. استخراج الحمض النووي الجيني هي الخطوة الأكثر.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
ليس لدي أي شيء في الكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر المؤسسة الكندية للإبداع ، ومعارف كولومبيا البريطانية وصندوق التنمية الوطنية للعلوم والهندسة مجلس البحوث (NSERC) من كندا لدعم الدراسات الجارية على المناطق المنخفضة من الأوكسجين مياه المحيطات والمناطق الساحلية المفتوحة. ودعمت طن متري والزمالات التي SL من مركز تولا مؤسسة ممولة للتنوع وتطور الميكروبية (CMDE). كما تلقى دعم MT الزمالة من جمعية الألمانية للبحوث (DFG).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Step II
CopyControl&# 8482; طقم إنتاج مكتبة FosmidEpicentre BiotechnologiesCCFOS110كافية لتوليد 9-10 مكتبات fosmid
SeaPlaque AgaroseCambrex50100
لوحة ساخنة تقليبCorningPC-420D
1.0X TAE تشغيل عازلة
CHEF Mapper XA نظام الرحلان الكهربائي للمجال النبضي بما في ذلك وحدة التبريد ومضخةمتغيرة السرعةBio-Rad
&# 955; DNA-HindIII DigestNew England BiolabsN3012S
MidRange I PFG MarkerNew England BiolabsN3551S
10,000X SYBR GoldInvitrogenS11494
غلاف بلاستيكي قابل للميكروويفالتفاف Saran التفاف
ممتاز آمن Imager TransilluminatorInvitrogenS37102
GELase Agarose Gel Digesting تحضيرEpicentre BiotechnologiesG09100
مشرطفيشر Scientific08-927-5D
Amicon Ultra-4 وحدة تصفية الطرد المركزي مع غشاء Ultracel-10EMD MilliporeUFC801024
Microcon YM-30 وحدة تصفية الطرد المركزي EMD Millipore42410
ماء خال من النوكليازAmbionAM9932
مجموعة فحص Quant-iT PicoGreen dsDNA * 2000 فحوصات * #InvitrogenP7589
سخان بلوك جاف رقميVWR الدولي12621-088
حمام مائيVWR الدولي14231-854
جهاز طرد مركزيBeckman Coulter Inc.أفانتي J-E
دوار الطرد المركزيبيكمان كولترJA 5.3
أجهزة الطرد المركزي على الطاولةEppendorf5415D
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ، 1.7 مل ، أنابيبAxygen ScientificMCT-175-C
15 مل Fisher Scientific430052
Step III< / strong>
LB مرقفيشر ScientificBP 1426-2
MgSO4< / sub>Sigma-AldrichM2643
عازلةالعاثية 10 ملي مولار Tris-HCl [درجة الحموضة 8.3] ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار MgCl 2< / قوارير >
مبردةفرعية فيشر Scientific430488
الخطوة الرابعة< / قوية>
96 صفيحة بئر مع غطاءفيشر ScientificCS003370 ( 3370)
384 صفيحة بئر بغطاءفيشر ساينتفيك07201157(3680)
أطباق بتري 100 OD × 15 مم HFisher Scientific08-757-12
أطباق بتري 150 Dia. × 15 مم Hفيشر ساينتفيك08-757-14
BD Falcon BioDish XL 245 × 245 ممVWR CABD351040
دولي جلسرينسيجما ألدريتشG5516
كلورامفينيكولسيجما ألدريتشC0378
رطل مرقفيشر ساینتفيكBP 1426-2
Difco AgarBD Biosciences214530
خرززجاجي فيشر ساینتفيك10-310-1
QFill3GenetixX3050
مبيضجافيكس
الإيثانولسيجما-ألدريتشE7023
15 مل أنابيب الطرد المركزيفيشر ساينتفيك430052
منتقي مستعمرة QPixرأس التقاط GenetixQPix2
(الإشريكية القولونية) GenetixX4006
الطرد المركزي تخفيف

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaikova, E., Hawley, A., Walsh, D. A., Hallam, S. J. Seawater sampling and. J Vis Exp. , (2009).
  2. Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. 28, (2009).
  3. Wright, J. J., Lee, S., Zaikova, E., Walsh, D. A., Hallam, S. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Environmental Genomic LibraryFosmid Library ProductionPulsed Field Gel ElectrophoresisDNA End RepairGel ExtractionPhage PackagingAutomated Colony PickingChloramphenicol SelectionEPI300T1 Resistant CellsQpix2 Robot

Related Articles