مقالة منهجية

تحجيم Fluidic صالحة للحقن الفيروسية استهداف سليمة دوائر الدماغ 3 - D

16.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/1489

⸱

يناير 21, 2010

 ,  , 
1Biological Engineering, Brain and Cognitive Sciences, and McGovern Institute, Massachusetts Institute of Technology

في هذه المقالة

ملخص

مراقبة وتحليل الدوائر العصبية في الجسم الحي يتيسر من التكنولوجيا لتسليم فيروسات والكواشف الأخرى ليحدد 3 الابعاد المرجوة من مناطق الدماغ. نظهر مجموعة مخصصة حاقن fluidic تصنيع وتسليم فيروسي ترميز المحسسات الضوئية ، مما يمكن التلاعب البصرية للدوائر الدماغ المعقدة.

الملخص

فهمنا من الدارات العصبية -- الطريقة التي توسط في العمليات الحسابية التي أيد الإحساس والفكر والعاطفة ، والعمل ، وكيف أنها معطوبة في الاضطرابات العصبية والنفسية -- وسوف يسهل كثيرا من التكنولوجيا لاستهداف الجينات بسرعة إلى 3 المعقدة -- الدوائر العصبية الأبعاد ، مما خلق السريع لل"المعدلة وراثيا على مستوى الدوائر." وقد طورنا أساليب مؤخرا في الفيروسات التي ترميز البروتينات الحساسة للضوء يمكن توعية أنواع معينة من الخلايا لتنشيط مقياس ميلي ثانية واحدة ، وإسكات في الدماغ سليمة. نعرض هنا تصميم وتنفيذ مجموعة حاقن القادرة على إيصال الفيروسات (أو سوائل أخرى) لعشرات من نقاط محددة داخل الهيكل 3 الأبعاد للدماغ (

البروتوكول

1. بناء المشبك التجسيمي

  1. يستخدم لربط المشبك التجسيمي الصفيف حاقن لstereotax ، بحيث تكون موازية لطريق الحقن في الذراع التجسيمي.
  2. كل احتياجات مختبر واحد فقط المشبك ، إلا أنه من المتوقع أن أكثر من عملية جراحية قد تحدث في وقت واحد. في هذه الحالة ، وجعل نفس العدد العدد الأقصى المتوقع لعملية جراحية في وقت واحد. قد يكون من المستحسن أيضا تقديم مبلغ إضافي ، في حالة الضرر الذي يلحق الأول.
  3. لجعل المشبك التجسيمي ، أولا ، هو قطع قطرها 1.5 مم الخارجي (OD) قنية الصلب إلى 2 بوصة في الطول ، وDremeled واحدة من تاريخ لأسفل حتى شقة.
  4. المقبل ، وقطع قطعة صغيرة (حوالي 0.5 X 0.5 سم) من الكلور متن بروتو ، لاستخدامها كفاصل.
  5. باستخدام الليزر القاطع لضمان أن أي تخفيضات التي هي عموديا على سطح المادة ، وقطع اثنين مستطيلات متطابقة (1 / 2 "س 3 / 8") من الأغطية 1 / 8 "الاكريليك ، كل مستطيل وجود اثنين من الثقوب الدائرية في عكس زوايا المستطيل. ثقب قطره 1.5mm الأولى التي ومجرد كبيرة بما يكفي لعقد قنية المعدن بإحكام. الثقب الثانية التي قطرها 1 / 16 "(الشكل 1C).
  6. يتم إدراج المعدن قنية في الحفرة 1.5 ملم واحد مستطيل ، ثم من خلال ثقب مم 1.5 من الثانية. يتم محاذاة نهاية الجزء السفلي من وجهه قنية مع الجزء السفلي من المستطيل السفلي ، والتي تشكل على شكل عصا الهوكي.
  7. مع الاحتفاظ باحكام هل عقدت بين المستطيلات اثنين ، وعزز هذا الهيكل معا باستخدام الغراء الساخن حول الثقوب قنية و1.5mm ، والحرص على تجنب الإلتصاق هل إلى مستطيلات. قد يكون من المفيد الصلصال لعقد الامور معا خلال هذه العملية.
  8. بعد الغراء قد جفت ، يتم إدخال المسمار في الحفرة 1-72 16/01 من الجانب العلوي من المستطيلات. ثم هو مشدود جوزة عرافة 1-72 إلى نهاية المسمار 1-72 ، وتشديد. المسمار والجوز يساعد على الاستمرار على المشبك معا.
  9. يتم إسقاط تولي عرافة الجوز على الوجه السفلي من المستطيل السفلي ، كميات صغيرة من 5 دقائق الايبوكسي حول حافة الجوز عرافة ، دون السماح للالايبوكسي للوصول الى المواضيع من عرافة الجوز أو المسمار. تتم إزالة أي الصلصال ، وأكد أنه يمكن عقد هل ثابتا في مكانه من خلال تشديد المسمار.

2. إعداد نظام لتخصيص مجموعة حاقن : هاميلتون المضخة وstereotax

  1. يمكن تخصيص مجموعة حاقن نظام لضبط أي تقريبا من الإحداثيات في الدماغ.
  2. ويقع أول مستخدم إحداثيات مواقع الحقن المطلوبة في الماوس (أو الأنواع الأخرى) الدماغ الأطلس ، وتحويل المناسبة إلى إحداثيات المستخدمة من قبل stereotax (هنا ، X ، Y ، Z والإحداثيات). عدد المواقع حقن (ثلاثة في الأرقام و1A 1B) وسوف يتم استدعاؤها الآخرة ك.
  3. يتم وضعها ك عدد 10 المحاقن هاميلتون ميكرولتر في مضخة حقن حقنة / انسحاب مثل هذا واحد من جهاز هارفارد.
  4. ويعلق بشكل آمن المقبل ، 3 أقدام طويلة قطع من أنابيب البولي ايثيلين الى إبرة حقنة كل من هاملتون.
  5. لكل قطعة من أنابيب البولي إثيلين ، وطائرة F - 252 كم من أنابيب العلمية أبتشيرتش هو تراجع عن نهاية مفتوحة ، وتعلق على محول أنابيب P - 627 باستخدام الجوز وشملت الطويق ، وهو أيضا من أبتشيرتش العلمية.

3. بناء صفيف الحاقن مخصص

  1. يتم تخصيص كل طائفة حاقن إلى مجموعة من الإحداثيات التي يختار المستخدم. ومع ذلك ، لمجموعات من الإحداثيات التي تختلف فقط من قبل / والترجمة أو التناوب ، ويمكن استخدام مجموعة حاقن نفسه.
  2. تفكر فقط X Y النسبية وإحداثيات لمواقع الحقن ، ويتم حفر ثقوب ك الى متن بروتو الكلور سمك 1 / 32 "، مع التباعد النسبي نفسه. يتم حفر هذه الثقوب باستخدام طاحونة صغيرة و0،011 Modela على" مثقاب من القطر ماكماستر ، كار. تأكد من استخدام معدل البطيء للحفر (Z - السرعة) لتجنب كسر أو تبلى بت الحفر. قبل إزالة لوحة من الطاحونة ، ويتم حفرها مستطيل حول الثقوب الصغيرة ، وذلك باستخدام أكبر قليلا من حفر قطرها 1 / 32 "، لتجنب استنزاف صغيرة واحدة يمكن أن تتولد رمز للطاحونة صغيرة بسهولة باستخدام MATLAB ؛ عينة يتم توفير التعليمات البرمجية في الملفات التالية.
    1. generate.m -- MATLAB رمز لتوليد Modela رمز من الإحداثيات المطلوبة
    2. holes_ex.rml -- Modela رمز لنمط الحفر الدائري (ثمانية ثقوب) في متن بروتو
    3. outline_ex.rml -- Modela رمز للمستطيل حفر ثقوب في جميع أنحاء
  3. 245 ميكرون هو قطع OD/100 ميكرومتر قطرها الداخلي (ID) أنابيب تنصهر السيليكا الشعرية ، متاح من تقنيات Polymicro ، إلى عدد كاف من 3 قطع بوصة. وتتألف هذه المستحقات عن طريق الحقن الفردية. غير مطعون قطعة من الأنابيب الشعرية المتاح من خلالكل من الثقوب ، لازالة الانقاض دون انسداد طريق الحقن الفعلية. يتم إدراج ثم عن طريق الحقن في منتصف الطريق في كل حفرة ، بحيث يتم احتجازهم بإحكام وموازية لبعضها البعض. وepoxied عن طريق الحقن لوحة ، وتشكيل هيكل مجموعة حاقن. كل ما تبقى هو تقليم عن طريق الحقن لمدة الصحيح.
  4. ويرد الصفيف حاقن إلى المشبك التجسيمي عن طريق وضع أحد أركان متن بروتو بين المستطيلات الاكريليك ، ومن ثم من خلال تشديد المسمار المشبك من التجسيمي. المقبل ، يتم إرفاق قنية المعدن المشبك إلى stereotax ، وذلك باستخدام آلية مرفق من stereotax.
  5. ويتم كل ما يلي تحت المجهر. واحد من طريق الحقن الخارجي (وهذا هو ، واحد يمكن أن يكون اقترب من الجانب مع حافة مستقيمة ، دون نتصادم أي من طريق الحقن أخرى) ، هو قطع رأس يمتد إلى أبعد من الجزء السفلي من اللوحة ، بروتو مع المقص. لحقن القشرية ، فمن المناسب أن يكون حاقن تمديد 5mm تقريبا خارج سطح اللوح - بروتو. لتعميق الحقن ، ويمكن زيادة هذا العدد من زيادة مماثلة في العمق. هو غيض بالارض بأداة DREMEL. ويمكن أيضا أن تكون نصائح حاقن الأرض بزاوية كإجراء وقائي ضد انسداد اضافية ، إذا الدقة في العمق أقل أهمية.
  6. المقبل ، يتم اختيار نقطة مرجعية ثابتة ضمن مجموعة من الذراع التجسيمي ، وسيتم نقل مجموعة حاقن بحيث الطرف المسطح لحاقن الخارجي ، وعند هذه النقطة المرجعية.
  7. يتم اختيار حاقن الثانية ، جنبا إلى جنب مع إحداثياتها المقابلة. نظرت هو الفرق النسبي في الارتفاع (Z - اتجاه) بين إحداثيات حاقن الأولى والثانية. تم نقل مجموعة حاقن على طول المحور Z من قبل هذه المسافة النسبية. وقلص حاقن الثاني وDremeled إلى طول الصحيح ، بحيث غيض من حاقن الثاني هو الآن في شقة وارتفاع النقطة المرجعية. يمكن نقل صفيف حاقن في X Y والاتجاهات لتسهيل المقارنة بين الطرف حاقن مع النقطة المرجعية.
  8. وتتكرر هذه العملية من أجل تقليم عن طريق الحقن المتبقية.

4. تجميع النظام بأكمله

  1. مطلوبة التجسيمي المشبك ومجموعة مخصصة حاقن ، سواء شيدت بالفعل ، لهذا الجزء.
  2. يتم إدراج نهاية ظهر كل حاقن (نهاية ألا يكون قد تم قطع) في الزرقاء F - 240 كم وأنابيب ، وذلك باستخدام P - 235 الجوز وP - 200 الطويق من أبتشيرتش العلمية ، هي التي تعلق على محول مترابطة متصلة بالفعل إلى المضخة بواسطة أنابيب البولي ايثيلين هاملتون. يمكن الاطلاع على تعليمات الشركة الصانعة للحصول على تفاصيل.
  3. باستخدام إبرة عيار 27 ، وحقن سيليكون النفط في الجزء الخلفي من المحاقن هاميلتون بحيث يتم تعبئة النظام بأكمله من الحقنة هاملتون إلى الطرف حاقن ، مع عدم وجود فقاعات الهواء على الاطلاق.
  4. كما هي الحقن هاميلتون إعادة وضعها في مضخة هاملتون ، هو الحفاظ على وحدة تخزين أكبر قدر ممكن من زيت السيليكون في المحاقن.
  5. إذا كانت التجربة يتطلب المزيد من الحقن مما هو مصمم لمضخة (اثنان في هذه الحالة) ، ويمكن متباعدة والمحاقن مع قطع صغيرة من البلاستيك (على سبيل المثال ، والقبعات إبرة) لإبقائهم موازية لبعضها البعض ، والتأكد من أن جميع القطع دفعت بواسطة مضخة إلى حد ذاته. أو ، يمكن شراؤها على ترقية رف متعددة من عدة أجهزة هارفارد لاجراء ما يصل إلى 10 المحاقن في آن واحد.

5. حقن / عملية جراحية

  1. عملية الحقن مع حاقن موازية هي مشابهة جدا لتلك التي عن طريق الحقن مع ماصة واحدة.
  2. فمن الضروري استخدام عبوة بطيئة / معدلات ضخ طوال هذه العملية ، لأن ضخ سريع قد يفرض المزيد من الضغوط على المفصل بين الأنابيب الكبيرة والصغيرة. أوصى أقصى معدل : 2 ميكرولتر / دقيقة لتحميل الفيروس ، و 0.1 ميكرولتر / دقيقة لغرس الفيروس.
  3. يتم وضع الماوس في stereotax تخدير ، ويبقى تخدير طوال التجربة.
  4. إعداد الماوس حسب الحاجة. على سبيل المثال ، مع مشرط ، يتم إجراء قطع واحد إلى أسفل خط الوسط من الجلد ، من بين عينيه إلى ما بين الأذنين. يتم سحب الجلد مرة أخرى لفضح الجمجمة ، ويتم تنظيف اللفافة قبالة. وترد ماصة الزجاج انسحبت إلى stereotax. يتم ضبط المواقف من القضبان الأذن حتى يتم محاذاة bregma وامدا إلى الارتفاع نفسه ، وحتى خط ربطها موازية للمحور Y من stereotax. موجهة محاور stereotax وفقا لنظام إحداثيات التي حسبت إحداثيات الحقن. وركزت على التجسيمي مع غيض من الزجاج في bregma ماصة ، ومن ثم يتم وضع طرف أعلى قليلا في الجمجمة وX - Y - إحداثيات أحد مواقع الحقن.
  5. باستخدام حفر الأسنان ، وقلص بعناية الجمجمة تحت الحافة بعيدا حتى لا تزال هناك طبقة رقيقة جدا من العظام. يمكن أن يكون أقل ماصة الزجاجاد ورفع للتأكد من أن يتم توسيط يجري حفر حفرة في الموضع الصحيح. باستخدام إبرة عيار 30 ، وبلطف التقطت قطعة صغيرة من طبقة قبالة ، في X - Y إحداثيات وتصحيح ، حتى إن ما يتعرض له جافية. وينبغي أن يكون هذا الثقب كبيرا بما يكفي لاحتواء واحد من طريق الحقن (0.25mm نطاق واسع). انظر الشكل 1D عن المخطط. في هذه الطريقة ، تتم ، 0.25mm ثقوب صغيرة في الجمجمة واسعة ، في X - Y - الإحداثيات والمقابلة لكل موقع الحقن.
  6. يتم تجاهل ماصة الزجاج في حاويات الأدوات الحادة ، ويتم إرفاق مجموعة حاقن مخصصة إلى stereotax باستخدام المشبك التجسيمي.
  7. من أجل تعيين بشكل صحيح من زاوية الصفيف حاقن ، يتم اختيار عضوين عن طريق الحقن الخارجي للمعايرة إلى نقطة مرجعية محددة ، على النحو التالي. بعد مطابقة واحدة من الحقن مع نقطة مرجعية ، والنظر في X - Y - النسبية والمسافات بين المواقع النسبية لهذه الحقن حاقن واحدة أخرى. يتم ضبط محاور stereotax بحيث يتم نقل كامل حاقن الصفيف في اتجاهات Y - X - لوهذه المسافات النسبية. إذا لم يتم محاذاة حاقن second الآن مع نقطة مرجعية ، وخففت قنية المعادن وتدويرها. وتتكرر هذه العملية حتى يتم تكرارا الزاوية الصفيف حاقن بشكل صحيح.
  8. قبل ملء طريق الحقن مع الفيروس ، وتمتلئ عن طريق الحقن مع زيت السيليكون حتى الحقن هي في النقطة 2 ميكرولتر (أو أكثر). وهذا يوفر منطقة عازلة ، بحيث يمكن أن تكون أي فقاعات الهواء أو انسداد في الطرف إزالتها بسهولة عن طريق دفع النفط إلى الأمام باستخدام مضخة هاملتون ، دون الحاجة إلى إعادة ملء النظام بأكمله مع زيت السيليكون من الجزء الخلفي من الحقن ، وصفه سابقا.
  9. يتم وضع قطعة معقمة من Parafilm على الجمجمة ، وخفضت بلطف عن طريق الحقن على أن Parafilm. ويمكن لينسق مع أعماق متفاوتة إلى حد كبير ، وهي مخصصة المضروب الجزء (مثل كائن على شكل درج) تسهيل التحميل.
  10. الأجزاء التالية تفترض أن 1 ميكرولتر من الفيروس يمكن تحميل في كل موقع (ينبغي تحجيم الكميات التالية من منصبه اذا والمطلوب بكميات أصغر). من أجل ضمان أن يتم حقن> 1 ميكرولتر من الفيروس في كل موقع ، وpipetted 1.5 ميكرولتر من الفيروس في Parafilm أو الدرج في طرف كل حاقن.
  11. مع معدل الملء من مضخة هاميلتون تعيين إلى 1 ميكرولتر / دقيقة ، يتم تعبئتها 1.2 ميكرولتر من الفيروس في كل حاقن.
  12. وركزت غيض من أطول في bregma حاقن ، ثم يتم إزاحة الصفيف حاقن إلى X - Y - الإحداثيات وذلك حاقن. إذا كان انسداد هو المشكلة ، ويقول إذا تم إشراك العديد من الأهداف العميق : حتى قبل إدراج نصائح حاقن في الدماغ ، فمن المستحسن أحيانا لبدء غرس المضخة ، حتى يمكن أن ينظر إليه من جميع الفيروسات الناشئة نصائح لحاقن. هذا يزيل أي فقاعات هواء في نصائح حاقن ، ويضمن أيضا عدم وجود انسداد. في حالة انسداد ، يتم تعيين مضخة هاميلتون لبث نبضة قصيرة في سرعة أعلى من 2 ميكرولتر / دقيقة ، واضحة إلى انسداد برفق.
  13. ثم يتم إنزال الصفيف حاقن ، من خلال ثقوب صغيرة مصنوعة مع الإبر 30 مقياس لعمق - Z الصحيح.
  14. يتم حقن 1 ميكرولتر من الفيروس من خلال كل حاقن ، عند 0.1 ميكرولتر / دقيقة.
  15. يتم ترك الحقن وحدها لمدة 30 دقيقة.
  16. بعد استخراج ببطء حاقن مجموعة من الدماغ ، يتم تعيين مضخة لضخ هاميلتون في نفس المعدل من 0.1 ميكرولتر / دقيقة ، وذلك للتحقق من انسداد في كل حاقن.
  17. ثم يتم تنظيفها من قبل إعادة تعبئتها عن طريق الحقن ، وغرس 1.5 ميكرولتر من الايثانول في 2 ميكرولتر / دقيقة.
  18. أخيرا ، يتم تعبئتها عن طريق الحقن مع زيت السيليكون للحفاظ على المنطقة العازلة 2 ميكرولتر في كل حقنة هاملتون.
  19. ويجب تعقيم كل المعدات قبل وبعد العملية ، وفقا لمؤسسة السلامة الأحيائية والبروتوكولات استخدام الحيوانات.

6. ممثل النتائج

الصفيف حاقن موازية يسرع عملية جراحية تقريبا بمعامل مساو لعدد من الحقن ، لا عد الإعداد والانتعاش مرة ، على الرغم من الأوقات الفردية سيعتمد على مهارة الممارس. لحقن ميكروليتر 1 ، رأينا عادة التعبير الفيروسة البطيئة في مجال قطرها حوالي 1MM (الشكل 1E). كانت دقة هذه الحقن أن التباين في المواقع غيض من المحاكمة إلى المحاكمة ، وكان حوالي 45 ميكرون (الانحراف المعياري للمسافة واحدة من موقف لموقف طرف الطرف المقصود).

figure-protocol-1
الشكل 1. تصميم وتنفيذ واستخدام مجموعة فيروس حاقن موازية. والتخطيطي ، من النظام الموازي مجموعة حاقن ، مما يدل على تكوين حاقن الثلاثي ، لمدة ثلاث حقن في وقت واحد. B ، صورة لمجموعة موازية حاقن الثلاثي تخطيطي كما هو الحال في . C ، التجسيمي المشبك ، كما هو موضح في المخطط من أعلى D ، التوضيح لكفاءة تقنية ، وفتح ، والضرر ، التقليل من ثقوب في الجمجمة لحاقن الإدراج في الدماغ : مع حفر الأسنان ، رقيقة الجمجمة وصولا الى ~ 50 ميكرون سمك ، ثم استخدم غيض من إبرة حادة لفتح حج القحف الصغيرة. E ، تظهر صورة مضان channelrhodopsin - 2 (ChR2) - GFP المسمى الخلايا في المناطق الماوس three القشرية ، كما استهدفت مجموعة من حاقن الثلاثي هو مبين في B.

المناقشة

في السنوات الأخيرة ، ومكنت عددا من راثيا ترميز المحسسات الضوئية إلى تنشيط الخلايا العصبية وإسكاتها في الجسم الحي بطريقة دقيقة ، زمنيا ، ردا على نبضات قصيرة من الضوء (على سبيل المثال ، 1،4،5،6،7،8 ، 11). وهناك طريقة أساسية مع الخلايا العصبية التي جرت توعية الضوء في المخ لدى الثدييات ، هو عن طريق الفيروسات مثل lentiviruses والغدة المرتبطة الفيروسات (AAV) ، والتي يمكن تقديم الجينات ترميز opsins لأدمغة الحيوانات تتراوح من الفئران إلى القرود ، في آمنة ودائمة أزياء (على سبيل المثال ، 2،9،10). فيروسات تسمح أسرع فترة زمنية من القيام المعدلة وراثيا ، وخاصة بالنسبة للكائنات الحية التي ليست نموذجية وراثية مثل الفئران والقرود ، وربما تمكن opsins مستويات التعبير العالية التي قد لا يكون ممكنا في سيناريوهات المعدلة وراثيا. هنا نظهر مجموعة حاقن موازية قادرة على خلق ، في فترة زمنية سريعة "على مستوى الدوائر المعدلة وراثيا" ، مما يمكن من الهياكل الدماغ بأكمله 3 الابعاد تستهدف فيروسي مع الجينات ، في خطوة واحدة جراحية. الصفيف تضم حاقن مضخات التشريد واحد أو أكثر من أن كل مجموعة من محرك الحقن ، كل منها تغذي السيليكا تنصهر - بوليميد / الشعرية عبر موصل الضغط العالي للملوحة. الشعيرات الدموية والحجم ، وإدراجه في ذلك الحين ، الأماكن المطلوبة التي حددها العرف الطحن لوحة المواقع المجسم ، وبالتالي السماح ليتم تسليمها الفيروسات أو الكواشف الأخرى لمجموعة المرجوة من مناطق الدماغ. لاستخدام الجهاز ، جراح يملأ أولا الفرعي fluidic تماما مع النفط ، backfills الشعيرات الدموية مع الفيروس ، وإدراج الجهاز في الدماغ ، وينفخ الكواشف ببطء (<0.1 ميكرولتر / دقيقة).

وسوف تمكن هذه التكنولوجيا طائفة واسعة من أنواع جديدة من التجارب ، مثل ميلي ثانية واحدة ، مقياس اغلاق التعقيد على شكل هياكل (مثل الحصين) في أوقات محددة أثناء السلوك ، تعطيل مؤقتا - الدقيق للهياكل الثنائية التي قد تعمل redundantly (مثل اللوزة اليمنى واليسرى) ، واضطراب من مناطق الدماغ منفصلة متعددة (على سبيل المثال ، والقيادة منطقتين متصلا من مرحلة دراسة كيفية التزامن عبر المنطقة يعتمد على النشاط داخل كل منطقة ، أو تحفيز المدخلات إلى المنطقة في الوقت الذي إسكات مجموعة فرعية من هذه الأهداف من أجل أن نفهم أي من عدة اهداف حاسمة للوساطة من آثار تلك المدخلات). لأدمغة كبيرة مثل تلك الموجودة في المدن الرئيسية ، والتي أثبتت لنا مؤخرا خلية نوع محدد التنشيط العصبي البصري 3 ، الاقلاق النشاط في منطقة سلوكيا ذات الصلة قد تتطلب وضع العلامات الفيروسية الهياكل الكبيرة والمعقدة. نلاحظ أنه يمكن استخدام موازية صفائف محقن لحقن أي ما يقرب من حمولة -- المخدرات ، neuromodulators ، العصبية ، أو خلايا من ذلك -- في أنماط 3 - D معقدة في الدماغ ، بطريقة دقيقة ، زمنيا. أخيرا ، من وجهة نظر متعدية ، فمن الممكن أن سرعة ، والعلاج الجيني للمرضى أو أجهزة مخصصة لتقديم الأدوية قد تكون سريعة صممت خصيصا لتتناسب وملفقة هندستها الدماغ الفردية ، ودعم علاجات جديدة لمجموعة متنوعة من الأمراض ، ومن المحتمل من خلال استخدام مراقبة الجزيئات الضوئية.

وقد صممت هذه المصفوفات حاقن على وجه الدقة ، مكانيا وvolumetrically. في X - Y - والاتجاهات ، ويتم ذلك من خلال حفر ثقوب دقيقة جدا وضعها غير مكلفة باستخدام طاحونة صغيرة ، مع فتحات كبيرة بما يكفي لاحتواء عن طريق الحقن ، وذلك عن طريق الحقن التي تقام بالتوازي مع بعضها البعض ، وفي الدقيقة الموقع. في Z - الاتجاه ، يتم قطع طريق الحقن باستخدام جهاز التجسيمي ، والسماح لمستوى الدقة يعادل ذلك من الجراحة نفسها التجسيمي. دقة الحجمي ينبع من دقة مضخة هاملتون ، وكذلك بالقرب من الصفر ميتا حجم الموصلات ، وتكييفها من اللوني السائل ذات الضغط العالي (HPLC) الحقل. تتم عن طريق الحقن من الأنابيب الشعرية السيليكا تنصهر فيها ، والتي هي قوية وصلبة بما فيه الكفاية أنه يحافظ على الشكل الدقيق والمباعدة بين الولادات تحت الضغط ، دون أن يكون سمك الجدار أكبر من البدائل مثل cannulas الصلب. ويمكن بسهولة أن يتم اجراء تعديلات بسيطة على التكيف مع الصفيف حاقن موازية لمجموعة متنوعة من التجارب. على سبيل المثال ، إذا كان المطلوب أصغر حجم فيروس أو تباعد أكثر دقة ، يمكن استخدام أنابيب أصغر الشعرية ، جنبا إلى جنب مع أصغر قليلا المقابلة الحفر. قد تستخدم في المستقبل أجهزة ميكروفلويديك قنوات ومضخات ، لزيادة عدد الحقن بالتوازي مع ذلك ، للتقليل من حجم (تمكين ربما تكون مثل هذه الأجهزة المركبة على رؤوس الحيوانات ، بحرية التحرك).

الإفصاحات

وكانت جميع الإجراءات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لحيوانات المختبر والتي وافق عليها رعاية الحيوان ومعهد ماساتشوستس للتكنولوجيا استخدام وجان السلامة الأحيائية.

شكر وتقدير

ESB يقر تمويل من جائزة مدير المعاهد الوطنية للصحة ومبتكر جديد (DP2 OD002002 - 01) ، NIH التحدي المنح 1RC1MH088182 - 01 ، NIH جراند فرص المنح 1RC2DE020919 - 01 ، NIH 1R01NS067199 - 01 ، جبهة الخلاص الوطني (0835878 و 0848804) ، وجائزة ماكغفرن Neurotechnology معهد برنامج وزارة الدفاع ، NARSAD ، ومؤسسة ألفريد بي سلون ، وجيري مارج بورنيت ، وجائزة بحوث SFN للإبداع في العلوم العصبية ، وسائل الإعلام مختبر معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا ، ومؤسسة Benesse ، وحاء كولتر والاس مؤسسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أداة دريميل (Dremel Tool)أداةDremel3956-02
قاطع ليزرأداةUniversal Laser SystemsVLS2.30
مسدس غراء ساخنأداةStanley BostitchGR20
مضخة حقن/سحب محقنية (مضخة هاميلتون)أداةHarvard Apparatus702001
محاقن هاميلتون بسعة 10 μlأداةHamilton Co701Nمطلوب محقنة واحدة لكل موقع حقن
جهاز تثبيت مجسم للفئران (Mouse stereotax)أداةStoelting Co.51725D
طاحونة صغيرة من طراز ModelaأداةRolandMDX-15
ريشة ثقب بقطر 0.011" للطاحونة الصغيرةأداةMcMaster-Carr8915A12
ريشة ثقب بقطر 1/32" للطاحونة الصغيرةأداةMcMaster-Carr8848A35
مثقاب أسنان عالي السرعةأداةLynx333
ملحقات مثقاب الأسنانأداةPearson AssessmentsF 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38
قنية من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر خارجي (OD) 1.5mmمادةSmall Parts, Inc.HTX-15R
برغي آلة مشقوق للربط 1-72مادةSmall Parts, Inc.MX-0172B
صامولة سداسية 1-72مادةSmall Parts, Inc.HNX-0172
لوحة تجارب PCB، بسمك 1/32"مادةDigi-KeyPC57-T-ND
لوح أكريليك، بسمك 1/8"مادةMcMaster-Carr8560K239
موصلات HPLCمادةUpchurch ScientificF-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (يمكن شراء بعض هذه الموصلات في عبوات من 10 قطع؛ ببساطة أضف ‘x’ إلى نهاية رقم القطعة)مطلوب موصل واحد لكل عملية حقن في كل موقع، باستثناء F-252 وP-627 وP-235 التي يمكن إعادة استخدامها
أنابيب شعرية من السيليكا المنصهرة، القطر الخارجي: 245 μm، القطر الداخلي: 100 μmمادةPolymicro Technologies2000022-10M
إيبوكسي عام الأغراض يجف في 5 دقائقمادةPermatex84101إيبوكسي عام الأغراض يجف في 5 دقائق
أنابيب بولي إيثيلين 0.066 × 0.095 بوصةمادةVWR international63018-827

المراجع

  1. Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing. Frontiers in Systems Neuroscience. 2009 Feburary 26, Slat Lake City, Utah, , Computational and systems neuroscience. (2009).
  2. Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration. Neuron. 50, 23-33 (2006).
  3. Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain. Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).
  4. Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  6. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution. PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).
  7. Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
  8. Lima, S. Q., Miesenbock, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
  9. Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).
  10. Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels. Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).
  11. Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحجيم Fluidic صالحة للحقن الفيروسية استهداف سليمة دوائر الدماغ 3 - D
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.