مقالة منهجية

التجمع ، والتحميل ، والمحاذاة لخلية نموذج تحليلي نابذة فائقة السرعة

DOI:

10.3791/1530

⸱

نوفمبر 5, 2009

 ,  ,  , 
1National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, Dynamics of Macromolecular Assembly, Laboratory of Bioengineering and Physical Science

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نابذة فائقة السرعة وتحليلية (AUC) خلية العينة يحمل عينة والعازلة المرجعية وخلال التجارب ، ويتعرضون للفراغ وسرعات عالية تصل إلى الدوار 60000 دورة في الدقيقة. وهذا الفيديو يظهر انتباه دقيق إلى التفاصيل اللازمة لتحميل والتجمع ومواءمة هذا العنصر مهم جدا من تجربة الجامعة الأمريكية بالقاهرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نابذة فائقة السرعة وتحليلية (AUC) هو أداة قوية تسمح لنا البيوفيزيائية لتسجيل ملامح ترسيب الجزيئات أثناء الطرد المركزي بسرعة عالية. عند تخطيط سليم وتنفيذ ، يمكن لسرعة الترسيب AUC أو الترسيب تجربة التوازن تكشف الكثير عن بروتين في ما يخص حجم وشكل ونقاء العينة ، ومعامل الترسيب ، والتفاعلات الدول oligomerization البروتين البروتين.

هذا الأسلوب ، ومع ذلك ، يتطلب مستوى دقيق من الاهتمام التقني. عينة الخلايا عقد مركز قطعة تقع بين مجالس قطاعية نافذة اثنين. ومختومة أنها ذات ضغط عزم دوران حول 120-140 في / رطل. يتم تحميل المخزن المرجعية والعينة في القطاعات محور ثم بعد الختم ، تتماشى تماما الخلايا في الدوار التيتانيوم بحيث أنظمة الكشف البصري على حد سواء عينة المسح والعازلة الإشارة في خط الوسط من خلال نفس المسار شعاعي محور كل قطاع في حين تناوب بسرعة تصل إلى 60 دورة في الدقيقة 000 ، وتحت فراغ عالية جدا

ليس فقط هو الصحيح التجميع خلية العينة الحرجة ، ومكونات الخلية عينة غالية جدا ويجب العناية بشكل صحيح لضمان أن تكون في حالة صالحة للعمل في المثلى لتجنب تسرب والكسر خلال التجارب. التعامل مع النوافذ بعناية ، حتى لأدنى الكراك أو خدش يمكن أن يؤدي إلى كسر في جهاز الطرد المركزي. يجب أن يكون محور الاتصال بين والنوافذ تكون ضيقة قدر الإمكان ، أي لا ينبغي حلقات نيوتن ق تكون مرئية بعد تطبيق ضغط عزم الدوران. يمكن الغبار ، والوبر ، وخدوش والزيوت على النوافذ أو محور كل حل وسط وهذا الاتصال بسهولة بالغة تؤدي الى تسرب من الحلول من قطاع إلى آخر أو تسرب للخروج من محور جميعا. لا يتم فقدان العينات الثمينة ، وتسرب من الحلول خلال التجربة سوف تسبب خللا في الضغط في الخلية التي غالبا ما يؤدي إلى تحطيم النوافذ والقطع المركزية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن الجوانات المكونات والمقابس بالسكن ينبغي أن تكون في مكان آمن لتجنب الحلول التي انسحبت من القطاع من خلال الثقوب محور التحميل من فراغ عالية في غرفة الطرد المركزي. يجب أن المتشددين النافذة وحشيات تكون خالية من التشققات وفواصل التي يمكن أن تسبب الحركة مما أدى إلى تحطيم النوافذ.

هذا الفيديو سوف تظهر إجراءاتنا التجمع خلية العينة ، وعزم الدوران والتحميل والمحاذاة الدوار للمساعدة في تقليل ضرر عنصر ، حل تسريب والكسر أثناء التجربة AUC الكمال.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عينة الجمعية خلية وعزم الدوران

  1. نبدأ البناء عينة الخلايا من خلال وضع إطار التجمعات معا 2.
    وضع طوقا نافذة على حامل الإطار. موقف بطانة الإطار (أو يسمى في بعض الأحيان وسادة النافذة) حامل داخل الإطار بحيث افتتاح بطانة هو العكس keyway حاملها. بزاوية طفيفة ، وضع الإطار في التوفيق بين صاحب العلامة الكاتب نافذة على الطريق الرئيسي مع صاحب النافذة. اضغط لأسفل برفق على حواف جدا على جانبي الإطار.
  2. ختم سليم لضمان دقة وعزم الدوران من الخلية عينة ، ونحن معطفا خفيفا طوقا الإسكان والحلبة مع زيوت التشحيم Spinkote المسمار. انتشار كمية صغيرة جدا من Spinkote بين الإبهام والسبابة. معطف المواضيع خاتم المسمار مع الفيلم ، رقيقة غير مرئية من Spinkote. وبالمثل ، معطف طوقا الإسكان. تمحو أي مواد التشحيم مرئية.
  3. يبدأ التجمع عينة الخلية عن طريق تحريك إطار تجميع واحد ، مع إطار مواجهة تجاهك ، في السكن الخلية عن طريق مواءمة keyway مع مفتاح السكن. محاذاة محور keyway مع مفتاح السكن والسماح لها سقوط برفق على الجزء العلوي من إطار التجمع داخل الخلية.
  4. أبدا استخدام أي نوع من أداة لدفع محور الإسكان في الخلية. هذا يمكن أن يسبب ضررا دائما لCP مما أدى إلى تسرب خلال التجارب. بدوره الجمعية النافذة الثانية بحيث تكون النافذة التي تواجه نحو محور ، بعيدا عنك ، محاذاة keyway مع مفتاح السكن والانزلاق إلى أسفل على أعلى من محور. مكان السكن طوقا على أعلى ، ثم حلقة المسمار حتى كلمة "مخرج" مرئيا. باستخدام أصابعك وأداة المحاذاة ، ومن جهة إحكام الطوق المسمار.
    إذا كان الحزب الشيوعي لا تنزلق بسهولة داخل برميل الإسكان ، وتوفيق لأول مرة ، بعد ذلك ، وضع التجمع النافذة الثانية على أعلى من ذلك. من خلال تطبيق الضغط النزولي لطيف على التجميع النافذة ، سواء في شريحة الإسكان الخلية في نفس الوقت. وبهذه الطريقة نتمكن من تجنب الضغط مباشرة على البرنامج القطري.
    الآن هو الوقت المناسب للنظر داخل الخلية لينت والغبار وبصمات الأصابع. ستلاحظ أيضا خواتم نيوتن التي تشير إلى أنه لا يزال الهواء بين الحزب الشيوعي والنوافذ. وسوف تختفي هذه بعد تطبيق عزم الدوران.
  5. مع عصابة المسمار وكلمة "الخروج" مرئيا ، ضع عينة الخلية على طول الطريق داخل الخلية كوليه عزم الدوران من الوقوف عزم الدوران. عقد في مكان الخلية عن طريق الضغط المستمر على التعامل مع عزم دوران الوقوف. في اقتراح واحد متواصل ، وتشديد الطوق المسمار الى ما بين 120-140 في رطلا. إذا باستخدام ميكرومتر تعديل عزم الدوران وجع ، تعيينها إلى ما بين 120-140 في / رطل وإحكام الطوق المسمار حتى تم التوصل إلى وجع "النقرات" مما يدل على عزم المجموعة. الافراج عن التعامل مع عزم الدوران والوقوف بعناية إزالة الخلية عينة دون لمس النوافذ.

وختم تحميل خلية نموذج

  1. للتجارب سرعة الترسيب ، ونحن بشكل روتيني تحميل حجم 400ul في كل قطاع من محور 12mm باستخدام ماصة 200ul. موقف خلية العينة مع ثقوب التحميل على رأس وكلمة "الخروج" على الحلقة المسمار مرئية. الشريحة النصف غيض ماصة صولا إلى القطاع محور اليسار من خلال الثقوب التحميل والاستغناء ببطء 200ul حل المرجع. أكرر مرة واحدة لمجموع 400ul. استخدام غيض ماصة نفسه ونفس الأسلوب ، بعناية وببطء ملء القطاع محور الحق مع 400ul حل العينة.
    وتستخدم كميات 150-180 UL للتجارب توازن الترسيب ولكن ينبغي أن يتبع نفس الرعاية والتقنية.

    لا بد من تطابق حجم العينة المرجعية وحلول بقدر الإمكان. تركيب طرف ماصة بشدة كي تستقر على ماصة ، تحميل ببطء والاستغناء عن حلول ، وتجنب فقاعات التحميل واستخدام غيض ماصة نفسها لكلا حلول كل المساعدات في الحفاظ على وحدات التخزين على قدم المساواة قدر الإمكان.
  2. ختم الخلية عن طريق وضع المكونات 2 جديدة الإسكان الحمراء جوانات بشكل مريح في كل فتحة التحميل والتأكد من أنها متوضعة بين قطعة سكنية ومركز الألمنيوم. تغطية كل المكونات مع السكن. ومن ناحية تشديد مع رئيس مفك شقة صغيرة.

عينة محاذاة الخلية في الدوار

  1. قبل تحميل الدوار ، تأكد من موازنة لا تتجاوز 0،5 ز أخف من خلية العينة في الموقف المعاكس في حالة الخلية التي تتسرب العينة. تبدأ مع توازن عند مستوى الصفر. وزن العينة الاولى الخلية التي ستكون في موقف معاكس لCB. الفارغة على التوازن الذي طرح الوزن خلية العينة ، ثم وزن CB. إضافة أو طرح الوزن من ثقب تعلق موازنة. تأكد من أوزان لا تبرز من الأعلى. Reweigh للتأكد من أن الوزن موازنة النهائي في غضون 0.5 ز أخف من خلية العينة المعاكس.
  2. باستخدام الدوار 4 - مكان ، ضع في موازنة المركز 4 بحيث السهم الأبيض مرئيا ومشيرا في رانه اتجاه القوة النابذة. تأكد من أنه على طول الطريق داخل الدوار. ربط مجموعة المسمار بلطف ، وجدت على قمة موازنة فقط عبر من السهم الأبيض ، حتى يتم موازنة ثابتة في مكانها ، ولكنها لا تزال قادرة على أن تكون محاذاة. موقف الخلية عينة متوازنة مع المقابس التي تواجه الإسكان وسط الدوار وكلمة "الخروج" على الحلقة المسمار مرئية.
  3. يبحث من تحت الدوار ، محاذاة علامة الكاتب الداخل (علامة الأقرب إلى وسط الدوار) مع علامة الكاتب على موازنة باستخدام أداة المحاذاة. تشديد المسمار تأمين موازنة لتعيين الانحياز في المكان. في نفس الطريق ، ومحاذاة الخلية الكاتب علامة مع عينة داخل علامة على موقف الكاتب 2 على الدوار.

لمزيد من المعلومات راجع https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/default.aspx

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجمعية الخلية السليمة ، أو الإدراج العينة ، والمحاذاة خلية في الدوار هو أمر حاسم لجودة عالية التجارب الجامعة الأمريكية بالقاهرة. هذا صحيح ، وعلى وجه الخصوص ، للتجارب التي تتطلب تحليلا مفصلا للغاية من البيانات المطلوبة على ملامح ترسيب الجزيئات ، على سبيل المثال ، عند دراسة التفاعلات البروتين وتحديد المبالغ الإجمالية التتبع. في كثير من الأحيان على جودة الإعداد التجريبية يحد عن دقة ودقة النتائج من دراسة بالجامعة الأمريكية. للاطلاع على تفاصيل عملية تصميم وتنفيذ المزيد من التجارب الجامعة الأمريكية بالقاهرة ، انظر المراجع 1 -- 3. ويجري حاليا عقد حلقات عمل تغطي عملية الإعداد ، من الناحية النظرية ، وتحليل البيانات من التجارب AUC مرتين في السنة في مختبرنا في المعاهد الوطنية للصحة [4].

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نعترف دعم البحوث من قبل برنامج بحوث جماعية من NIBIB ، المعاهد الوطنية للصحة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4 أماكن Ti الدوار التحليليBeckman Coulter Inc.361964
عزم الدوران التجمعبيكمان كولتر ، Inc.361318
أداة محاذاة الخليةBeckman Coulter Inc.362340
سبينكوت زيوت التشحيمبيكمان كولتر306812
موازنةبيكمان كولتر ، Inc.360219
مجموعة الإسكان الخلويةBeckman Coulter Inc.334602
حشية النافذةBeckman Coulter Inc.327021
بطانة النافذةBeckman Coulter Inc.نافذة 362329
، الياقوتبيكمان كولتر إنك.نافذة 307177
، شركة كوارتزبيكمان كولتر301730
حامل النافذةBeckman Coulter Inc.305037
12 مم القطاع المزدوج Epon المركزيةBeckman Coulter Inc.306493
حشوات قابس الخليةBeckman Coulter Inc.327022
قابس مبيت الخليةBeckman Coulter Inc.362327

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, P. H., Balbo, A., Schuck, P. Characterizing protein-protein interactions by sedimentation velocity analytical ultracentrifugation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.15-Unit 18.15 (2008).
  2. Balbo, A., Brown, P. H., Braswell, E. H., Schuck, P. Measuring protein-protein interactions by equilibrium sedimentation. Curr Protoc Immunol. Chapter 18, Unit 18.8-Unit 18.8 (2007).
  3. analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit [Internet]. , Peter Schuck. Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm Forthcoming.
  4. Home - Workshops [Internet]. , National Institutes of Health. Available from: https://sedfitsedphat.nibib.nih.gov/workshop/default.aspx Forthcoming.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Sample Cell AssemblyTorque PressureWindow AssemblyCenterpiece AlignmentReference Buffer LoadingSample Solution LoadingHousing Plug GasketsCounterbalance WeightRotor Alignment

مقالات ذات صلة