في الفك العلوي الزرد بربل هو هيئة المعنى غلافي تحتوي الأدمة ، أرومية متوسطة ومشتقاتها قمة العصبية. الأهم من ذلك ، يمكن تجديد بربل الكبار بعد بتر القريبة. يقدم هذا الفيديو الفك العلوي بربل التنمية ويوضح البروتوكول الجراحية للحث على التجدد ، تليها التصوير جمع ودمج والمصب من العينات باربيل.
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Barbels والزوائد الجلدية الحسية الموجودة في الأسماك والزواحف والبرمائيات. والزرد ، دانيو rerio وتطوير اثنين من أزواج من barbels - زوجا الأنف القصير وزوج يعد الفك العلوي. بربل الأنسجة يحتوي على خلايا الأدمة ، وأديمي متوسطي المنشأ العصبية العرف ، بما في ذلك خلايا الجلد والغدد وبراعم الذوق ، الخلايا الصباغية ، الأوعية الدموية والاعصاب الحسية. خلافا لمعظم أنسجة البالغين ، وبربل الفك العلوي واضح بصريا ، مما يسمح لنا تصور تطوير وصيانة هذه أنواع الأنسجة في جميع مراحل الحياة.
هذا الفيديو يبين التطور المبكر للبربل الفك العلوي (بداية شهر واحد تقريبا بعد الإخصاب) ، ويوضح البروتوكول الجراحية للحث على التجدد في أطرافهم الكبار (> 3 أشهر بعد الإخصاب). باختصار ، هو ارتفاع في بربل الفك العلوي الأيسر من سمكة تخدير مع ملقط معقم القاصي فقط إلى الحافة الذيلية للفك العلوي. يتم وضع غرامة ، مقص الربيع العقيمة ضد ملقط لخفض رمح بربل على هذا المستوى ، وإنشاء المعالم التشريحية للطائرة البتر. ويمكن قياس النمو التجديدي مع الاحترام لهذه الطائرة ، وبالمقارنة مع بربل المقابل. بربل الأنسجة تتجدد بسرعة ، وقد يصل الحد الأقصى إعادة نمو في حدود 2 اسابيع من الاصابة.
تقنيات لتحليل مجدد بربل تشمل تشريح وتضمينها أزواج متماثلة لbarbels (تجديد والسيطرة) في الآبار من هلام DNA الكهربائي القياسية. يتم تصويرها بسهولة العينات جزءا لا يتجزأ من تحت stereomicroscope عن مورفولوجيا الإجمالي وقياس الأشكال ، ويمكن تخزينها لمدة أسابيع قبل التطبيقات المصب مثل الأنسجة البارافين ، cryosectioning ، و / أو كليا جبل المناعية. هذه الأساليب إنشاء بربل الفك العلوي كما في رواية نظام الأنسجة الحية لدراسة القدرة على التجدد من أنواع خلايا متعددة في سياق الجيني للالزرد.
البروتوكول
تربية الزرد
ويضم الزرد وتربيتها وفقا للأساليب القياسية 1. الفترة الماضية من اليرقات في وقت متأخر ، ويمكن قياس المرحلة التنموية التي من الزرد طوله القياسي (SL) ، أو على مسافة خط مستقيم في ملليمتر من وجهة anteriormost من الشفة العليا إلى قاعدة الزعنفة الذيلية (لوحة hypural تأخرا) 2. في حوالي شهر واحد آخر الإخصاب (10-12 ملم SL) ، والأنف والفكين barbels تظهر براعم الظهارية شفافة وحفر بالقرب من حاسة الشم ، وعلى الزوايا الخلفية للفك ، على التوالي. كما ينضج الزرد ، وتمتد إلى barbels ضيقة تشبه الزوائد الطولي. لأن بربل الفك العلوي أكبر (2-3 ملم) وأسهل في التعامل معها ، لدينا بروتوكول ينطبق فقط على هذا أطرافهم خاصة ، وتقنيات مشابهة ، ومع ذلك ، يمكن تكييفها لبربل أصغر الأنف.
بربل قطة
- تخدير الزرد الكبار في المرحلة المطلوبة (على سبيل المثال. ، 1،5-2،5 سم SL ، ~ 3-6 أشهر بعد الإخصاب) من قبل الانغماس في 0،015 ٪ MS - 222 (3 - إيثيل أمينوبنزوات methanesulfonate) مخزنة إلى 7.0 درجة الحموضة في المياه النظام. مراقبة حركات السباحة حتى وقف والتهوية الخيشومية تصبح بطيئة ومنتظمة. تبعا لحجم الأسماك ، والتخدير الكامل يستغرق حوالي 2-5 دقائق.
- باستخدام شبكة صيد السمك حوض السمك ، ونقل الأسماك 1-3 في وقت لقطعة مطوية من منشفة ورقية مبللة في طبق بتري. باستخدام ملعقة حادة ، توجيه السمك بحيث تكون موازية للجانب كل الأطراف الأخرى وتركها. أضعاف جزء من منشفة ورقية مبللة على جزء الذيلية للأسماك ، الذي يغطي الجسم كله حتى الوصاد (الخيشومية يغطي) للحفاظ على الجلد والخياشيم رطبة أثناء العملية.
- عرض لوحة بيتري تحت stereomicroscope ، وذلك باستخدام المنخفضة زاوية ضوء الحادث لإلقاء الضوء على منطقة الرأس. التركيز على قاعدة باربيل في الفك العلوي الأيسر ، الذي يبرز من الزاوية بطني الخلفي من الفك العلوي (الشكل 1).
الشكل 1. - فهم بإحكام رمح من بربل البعيدة قليلا إلى حافة الفك العلوي. رفع رمح باربيل وتدرج بين فكي مقص الربيع الجميلة ذات الرؤوس القريبة عادل للملقط. ويمكن لمس مقص للملقط لتحقيق الاستقرار. انزلاق فكي مقص على طول رمح من بربل حتى حافة القطع تقترب من حافة الفك العلوي. إغلاق المقص لقطع طريق رمح باربيل. وبترت باربيل ، لا تزال في قبضة الملقط ، يمكن إزالة التثبيت أو لمزيد من المراقبة.
- نقل على الفور إلى خزان الأسماك الصغيرة من المياه النظيفة نظام (~ 500 مل) تحتوي على قطرة واحدة من الميثيلين الأزرق لمكافحة العدوى الفطرية السطحية. السماح للأسماك لاسترداد بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، وعودة الأسماك إلى نظام التربية. بربل التجدد هو القصوى بعد 2 أسابيع.
التضمين آغار من أزواج بربل متطابق
- جمع السمك بواسطة تقنية القتل الرحيم المناسبة والإصلاح في أنبوب 50 مل من 4 ٪ بارافورمالدهيد فوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع الهياج عند 4 درجات مئوية خلال الليل. ينبغي أن يكون حجم تثبيتي ، لا يقل عن عشرة أضعاف حجم الأنسجة. بعد التثبيت ، والتخلص من النفايات في حاوية بارافورمالدهيد المعتمدة وشطف جيدا في أنسجة عدة تغييرات في برنامج تلفزيوني.
- يعد في زجاج مل 250 مل 150 قارورة من 2 ٪ agarose (T م ~ 37 درجة مئوية) في الماء المقطر. الحرارة مع الميكروويف أو صفيحة ساخنة ، تهييج دوريا حتى تتفكك. يوازن الحل المنصهر في حمام ماء 50-60 ° C.
- تجميع هلام إستشراد القياسية تلاعب بوضع الصغيرة العفن هلام gasketed (10 × 10 سم ، ~ جل 100 مل الحجم) بحزم ضد جانبي الغرفة العازلة. إضافة 2-4 صغير ذو أسنان المشط العينة (4 × 1.5 مم).
- على سطح مستو ، صب agarose ذاب في القالب فقط لتغطية قاعدة أمشاط ، وتشكيل الآبار الضحلة جدا. وضعت على الفور agarose بقايا العودة الى حمام ماء دافئ ، وسيتم استخدامها لاحقا لتضمين هذا النسيج (خطوات 9-12). وضع الزجاج طويلة ماصة باستور في قارورة للحفاظ على ماصة للحرارة نفس agarose.
- السماح للهلام لتتصلب لمدة 20-30 دقيقة. إزالة كومز ، ثم إزالة العفن الذي يحتوي على هلام هلام صلابة من الغرفة العازلة. الشريط بقوة الجانبين مفتوحة من العفن هلام مع الشريط المختبر حتى الجل لا تنزلق. وينبغي توسيع نطاق هذا الشريط عدة مليمترات على سطح agarose بحيث يمكن إضافة agarose إضافية في وقت لاحق (الخطوة 13).
- موقف العفن هلام على مرحلة من مراحل stereomicroscope. تكبير بئر فارغة وتقديمهم إلى حواف التركيز.
- على سطح من agarose المتاخمة للبئر ، ماصة قطرة ماء أو العازلة التي تحتوي على عينات بربل الثابتة (على سبيل المثال ، تجديد والتحكم). USIدبابيس عازمة نانوغرام الحشرات ، وسحب العينات رطبة في البئر ودفعهم الى القاع. توجيه مهاوي بربل موازية لبعضها البعض والانحياز ضد حواف طويلة العكس من البئر. وسوف يعقد التوتر السطحي مساعدة النسيج في الموقف.
- عندما تصبح مستعدة لتضمين ، استخدام غيض ماصة الغرامة أو زاوية مختبر الانسجة لازالة السوائل الزائدة من البئر. العمل بسرعة حتى لا السماح للنسيج تجف.
- باستخدام ماصة باستير حرارة الزجاج ، ماصة بلطف agarose المنصهرة جديدة داخل وحول عينات الأنسجة لختم باربيل في المكان. لا يفيض. قبل agarose يصلب ، وجعل تعديلات في اللحظة الاخيرة مع دبابيس الحشرات.
- وضع ورقة مرقمة عينة التسمية بجوار البئر وآمن مع هبوط صغير من agarose.
- كرر الخطوات من 6 إلى 10 لكل بئر من العينات.
- إذا رغبت في ذلك لمعايرة الصور ، اضافة الى وجود قطعة من الورق مع مقياس ميكرومتر المطبوعة (على سبيل المثال ، http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ ) في أسفل فارغة أيضا. تتسطح الورقة إلى قاع البئر ، وتغطي مع agarose الدافئة.
- بعد هي جزء لا يتجزأ من جميع العينات ، وعلى سطح هلام يكون غير منتظم ، مع قطرات من تصلب agarose. وضع الجل على سطح مستو وتصب بلطف في agarose ذاب اضافية حتى السطح العلوي هو موحد. استخدام أقل قدر من agarose اللازمة للحصول على سطح أملس ؛ الكثير agarose سوف يحجب الضوء ينتقل التصوير الفوتوغرافي. تسمح هذه الطبقة العليا لتتصلب.
- ويمكن الآن للهلام يتم تصويرها على المسرح لstereomicroscope لتسجيل مورفولوجيا الإجمالي لكل زوج باربيل. يتم الحصول على ذلك عن طريق تصوير صورة معايرة مقياس ميكرومتر المضمنة.
- ويمكن تخزين الجل بأكمله ملفوفة في ورقة المناشف المبللة ومختومة في كيس من البلاستيك عند 4 درجة لعدة أسابيع.
- لمزيد من التحليل ، يمكن خفض آغار كتل تحتوي على زوج متطابق من barbels من هلام بشفرة حلاقة ومشرط أو المجهزة للالبارافين أو الأنسجة cryosectioning بالطرق العادية 3،4. بدلا من ذلك ، يمكن تشريح barbels الفرد من agarose الإبر مع غرامة ، وتشطف في الماء ، وتجهيزها لتطبيقات المصب الأخرى (على سبيل المثال ، كلها أو جبل المناعية مبائر المجهري).
المناقشة
في الفك العلوي الزرد بربل هو نظام الأنسجة غير المستغلة لدراسة النمو وصيانة وتجديد العديد من أنواع الخلايا في الزرد. على الرغم من أن ليس لديه ذيل بربل التناظرية الإنسان ، والحفاظ عاليا أنواع الخلايا التي يحتوي عليها ، مما يجعل من الممكن دراسة الجلد والغدد والأوعية الدموية الصباغية ، والأعصاب في بنية أسطوانية واضحة وبسيطة بصريا تشريحيا. مشابهة للزعنفة الذيلية مدروسة ، ويمكن أن يكون ذلك حافزا لتجديد أنسجة بربل بواسطة البتر. به حدود الفك ومعلما التشريحية ، يمكن وضع الطائرة بتر بدقة ، وتسهيل إعادة نمو قياس باربيل. لعامل الخبرة ، كل جراحة يستغرق سوى بضع ثوان. الانتعاش السريع ، وليس لدينا حتى الآن الكشف عن أي آثار قصيرة أو طويلة الأجل على سلوك الأسماك. الزرد مع واحدة تسبح بربل الفك العلوي ، وتناول الطعام وتتكاثر بشكل فعال كما غير الجراحية الضوابط ، ويكون البقاء للمقارنة إلى الوقت لجمع الأنسجة ، وتصل إلى 6 أشهر بعد الجراحة. وتوقع الأثر الفسيولوجية لهذه الجراحة أن يكون الحد الأدنى ل1) تم العثور أيضا على براعم الذوق خارج الفم محمولا على بربل على أجزاء أخرى كثيرة من الأسماك ظهارة ، بما في ذلك الشفاه والخدين والرأس 5 ، و 2) براعم الذوق التفريق تظهر على بربل وتجديد في غضون 72 ساعة (وكلير وآخرون ، بيانات غير منشورة.) وهذا يجعل من نظام الفك العلوي بربل مينيملي لدراسة التئام الجروح ، وعودة التوعي ، وعودة التعصيب ضمن سياق الفقاريات الكبار.
بعد تحريض الجراحية للتجديد ، يمكن جمعها على فترات barbels لقياس morphometric و / أو التحليل المجهري للانسجة محددة. مريح ، والفك العلوي بربل تقريبا طول (2-3 ملم) وقطرها (100-200 ملم) من جنين الزرد ، وتسهيل تطبيق البروتوكولات القياسية عديدة ، بما فيها الأنسجة البارافين ، cryosectioning ، المناعية كلها جبل ، وفي الموضع التهجين. أخذت معا ، وهذه الميزات تجعل من الفك العلوي بربل خيارا ممكنا للغاية في الجسم الحي نموذج لدراسة إصلاح الأنسجة وتجديدها.
شكر وتقدير
وقد وضعت هذه الأساليب التي كتبها ثعبان البحر خلال إجازة البحوث في مختبر JT وقدم الدعم من قبل مجلس جامعة ديبول البحوث والمعاهد الوطنية للصحة / NIDCR R01 منحة لJT (DE016678). نحن الامتنان لجهود هنتر كارولين والحيوان فني الرعاية الأساسية في CMRC مرفق الزرد وبولينا Pawluczuk مساعد مختبر لدينا في المرحلة الجامعية.
المواد
مجهر معدات
مطلوب مجهر تشريح ستيريو مع الحادث وأحال إضاءة من الألياف الضوئية لقطة باربيل وتضمينها آغار.
بربل قطة
- الأسماك نظام المياه
- 2 الزرد عبور الدبابات
- MS - 222 (3 - إيثيل أمينوبنزوات methanesulfonate ؛ سيغما الكيميائية # E10521 - 10G)
- طبق بتري معقمة من عيار 120 ملم
- مناشف ورقية مبللة
- ملعقة معدنية حادة
- # 55 دومون بيو INOX الملقط (أدوات العلوم الجميلة # 11255-20)
- مصغرة Vannas مقص الربيع (العلوم أدوات الجميلة # 15000-00)
- عامل مضاد للفطريات الميثيلين الأزرق (Drs. فوستر أند سميث # CD - 905781)
- شبكة صيد السمك حوض السمك الصغير
جمع الأنسجة وتضمينها آغار
- 4 ٪ في بارافورمالدهيد 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PF - PBS) ، حتى aliquoted في أنابيب مخروطية 50 مل وتخزينها في المجمد -20 درجة مئوية استخدام
- 1X الفوسفات مخزنة المالحة (الرقم الهيدروجيني 7،27-6)
- قارورة 250 مل زجاج
- 2 ٪ agarose في الماء المقطر
- معيار صغيرة agarose هلام إستشراد تلاعب (هلام حجم = ~ 10 سم مربع)
- مشط ذو أسنان صغيرة عينة الكهربائي (مشط حجم 4 × 1.5 مم)
- حمام دافئ الماء (50-60 درجة مئوية)
- مختبر الشريط
- مطلي بالمينا السوداء دبابيس الحشرات ، وحجم 000 (العلوم أدوات الجميلة # 26000-25)
- أصحاب دبوس 1-2 (أدوات العلوم الجميلة # 26016-12)
- 9 بوصة زجاج ماصة باستير
- لمبة أو مضخة ماصة
- مختبر الأنسجة
- ملصقات ورقية صغيرة
- (اختياري) معايرة مقياس المطبوعة
- مناشف ورقية مبللة
- إغلاق الرمز البريدي كيس من البلاستيك
- مشرط / شفرة الحلاقة (لقطع كتل آجار)
المراجع
- Westerfield, M. Chapter 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam). 56, 1-7 (2002).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols. 6, (2008).
- Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th ed., Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Hansen, A., Reutter, K., Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn. 223, 483-496 (2002).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
