الحقن المباشر للintranuclear [كدنا] هو أسلوب فعال لترنسفكأيشن بعد الإنقسامية الخلايا. هذا الأسلوب يوفر مستويات عالية من بروتين تعبير مغاير من يبني [كدنا] واحدة أو متعددة ، وتمكن وظيفة البروتين لدراستها في بيئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية مع مجموعة متنوعة من المقايسات خلية واحدة.
مقالة منهجية
Intranuclear Microinjection من الحمض النووي في الخلايا العصبية فصل الثدييات الكبار
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلية العصبية الأولية الثقافات هي أدوات قيمة لدراسة وظيفة البروتين لأنها تمثل نظاما بيولوجيا أكثر أهمية بالمقارنة مع خطوط الخلايا خلده. ومع ذلك ، وطبيعة مرحلة ما بعد الإنقسامية من الخلايا العصبية الأولية يمنع فعالية بروتين تعبير مغاير باستخدام إجراءات مشتركة مثل electroporation ترنسفكأيشن كيميائيا أو بوساطة. وبالتالي ، يجب أن يوظف تقنيات أخرى من أجل التعبير عن البروتينات بشكل فعال في هذه الخلايا غير الانقسام.
في هذه المقالة ، نحن تصف الخطوات المطلوبة لتنفيذ عمليات الحقن intranuclear من يبني [كدنا] في فصل الخلايا العصبية المتعاطفة الكبار. يمكن لهذا الأسلوب ، الذي تم تطبيقه على أنواع مختلفة من الخلايا العصبية ، وتحدث بنجاح غيروي بروتين تعبير. المعدات الأساسية لهذا الإجراء يشمل microinjection مجهر مقلوب لتصور خلايا ، والماصة حقن زجاجية مملوءة بمحلول [كدنا] متصلة (أ) 2 N (ز) الضغط نظام التسليم ، وmicromanipulator ملف. وينسق الحركة micromanipulator حقن الماصة microinjection مع نبضة قصيرة من الضغط N 2 إلى إخراج حل [كدنا] من طرف الماصة.
هذا الأسلوب لا تملك سمية المرتبطة العديد من الأساليب الأخرى ويتيح ترنسفكأيشن بنيات متعددة لتكون الحمض النووي التي أعرب عنها في نسبة ثابتة. انخفاض عدد خلايا حقن يجعل الإجراء microinjection مناسبة تماما للدراسات خلية واحدة مثل التسجيلات الكهربية والتصوير الضوئي ، ولكن قد لا تكون مثالية لفحوصات البيوكيميائية التي تتطلب عددا أكبر من الخلايا وكفاءة أعلى ترنسفكأيشن. على الرغم من microinjections intranuclear تتطلب استثمارا في المعدات والوقت ، والقدرة على تحقيق مستويات عالية من بروتين تعبير مغاير في بيئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية يجعل هذه التقنية أداة مفيدة جدا للتحقيق في وظيفة البروتين.
البروتوكول
أولا التحضير للحقن
هذا المقطع يصف الخطوات التي تحتاج إلى إعداد تؤخذ عن طريق الحقن قبل [كدنا] في نواة الخلايا العصبية. الإجراء العزلة عن الخلايا العصبية هي خارج نطاق هذه المقالة ، ولكن من المهم أن يكون فصل الخلايا العصبية في خلايا فردية والتمسك جيدا على السطح السفلي من 35 ملم أطباق زراعة الخلايا (انظر مناقشة للحصول على نصائح مفيدة لتحقيق ذلك). على الرغم من أن يحتمل مجموعة متنوعة من الخلايا العصبية مختلفة يمكن استخدامها ، ويفضل العقد الطرفية مثل العقد في عنق الرحم متفوقة (SCG) أو العقد الجذرية الظهرية للتشريح لأنها متاحة بسهولة ، وتسفر عن عدد كبير من الخلايا العصبية. مزايا إضافية من استخدام الخلايا العصبية SCG هي أنها مجموعة من السكان متجانسة نسبيا من الخلايا ويتميز 1،2،3،4 جيدا.
A. إعداد البلازميد [كدنا] للحقن
- لمنع التلوث أو انهيار الحمض النووي ، يجب ارتداء القفازات أثناء إعداد.
- الحمض النووي هو subcloned ترميز البروتين من الاهتمام إلى ناقل التعبير الثدييات مناسبة ، مثل PCI (Promega ، ماديسون ، ويسكونسن) ، في إطار تنظيم المروج نشطة وعالية constitutively (CMV) المضخم للخلايا. إذا لم يتم تسمية هذا البروتين ، وهو مراسل البلازميد ، هو ترميز EGFP على سبيل المثال (pEGFP - N1 ، BD Clontech العلوم البيولوجية ، بالو ألتو ، كاليفورنيا) ، وشارك في حقن حقن لتأكيد النجاح والتعبير. يتم عزل الحمض النووي باستخدام العازل عالية الجودة العمود (على سبيل المثال QIAfilter ميدي الإعدادية عدة ، Qiagen ، وتشاتسوورث ، كاليفورنيا) وتنقيته أخرى باستخدام وحدة الطرد المركزي فلتر مع فلتر PVDF (0،1 ميكرون ، ميليبور ، بيدفورد ، ماجستير) لإزالة الجسيمات في البلازميد التحضير ، والتي يمكن أن تعرقل pipets الحقن خلال عملية الحقن. يتم تخزين في البلازميدات -20 درجة مئوية في تركيز ما يقرب من 1 ميكروغرام / ميكرولتر في الحمض النووي العازلة التخزين المناسبة (مثل TE العازلة : 10 مم تريس ، 1 ملم EDTA ، ودرجة الحموضة 8.0).
- مباشرة قبل microinjection ، مخففة cDNAs البلازميد والمختلط الى التركيز المطلوب في المباراة النهائية العازلة TE أو H 2 O. عادة ، 50-10 نانوغرام / ميكرولتر من الجين مراسل كافية لحقن الخلايا التسمية ، والتركيز الكلي من [كدنا] ليتم حقنه لا ينبغي أن يتجاوز 200 نانوغرام / ميكرولتر منذ الحمض النووي هو لزج بتركيزات عالية ويمكن أن تسد pipets الحقن. ويتم إعداد كمية صغيرة من [كدنا] للحقن (ميكرولتر 5-10) بواسطة قطرات من محلول الخلط على سطح نظيف لقطعة صغيرة من Parafilm (الجانب تحت دعم ورقة). مزج قطرات من الحل معا pipeting صعودا وهبوطا عدة مرات مع pipetor وتجنب إدخال فقاعات الهواء خلال عملية الخلط.
- تلميح باستخدام الماصة microloader (إيبندورف ، برينكمان الآلات ، ويستبري ، نيويورك) ، ونقل إلى الحل [كدنا] انبوب الهيماتوكريت أعدت خصيصا (فيشر العلمية ، بيتسبرغ ، بنسلفانيا). انظر مواد الباب للحصول على تعليمات حول إعداد أنابيب الهيماتوكريت (مواد الجدول). وضع أنبوب الهيماتوكريت تحتوي على حقن محلول في أنبوب [كدنا] مل microcentrifuge 1.5.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب لل15-30 دقيقة على 000 ز 10 في microcentrifuge مجهزة الدوار دلو الزاوية الثابتة أو يتأرجح (إيبندورف) ، في درجة حرارة الغرفة (20-24 درجة مئوية) لجزيئات الرسوبيات في الحل [كدنا] التي قد تسد microinjection الماصة. يمكن أن تظل الحل الحقن [كدنا] في درجة حرارة الغرفة خلال الدورة الحقن.
باء تلفيق pipets الحقن
- المتاح pipets microinjection زجاج متوفرة تجاريا (Femtotips على سبيل المثال ، إيبندورف) ، والتي هي مريحة ولكنها مكلفة (10 دولار لكل الماصة microinjection). يمكن تصنيعها pipets الحقن في المختبر باستخدام P - 97 برمجة يلهب مجتذب الماصة براون (سوتر شركة الصك ، نوفاتو ، CA) والخيطية ، رقيقة الجدران أنابيب الزجاج البورسليكات الشعرية (الآلات الدقيقة العالمي ، ساراسوتا ، فلوريدا). هذا الخيار هو أكثر فعالية من حيث التكلفة ويسمح للسيطرة على شكل وحجم microinjection الماصة.
- ويستخدم البرنامج على مرحلتين لسحب ضيقة نصائح microinjection الماصة. منذ افتتاح pipets microinjection ضيق جدا لتفحص تحت المجهر ضوء ذلك ، فإن نوعية pipets الحقن يجب أن يتم تقييمها بشكل مباشر عن طريق حقن الخلايا قليلة قبل أن يتم الانتهاء من إعدادات البرنامج. وفيما يلي إعدادات التقريبية لضبط الحرارة ، وسحب والسرعة والوقت : (سحب 1) 600 ، 115 ، 15 ، 250 ؛ (سحب 2) 640 ، 130 ، 65 ، 200. تختلف هذه الإعدادات مع دفعات مختلفة من الزجاج وحالة من خيوط التدفئة في مجتذب ، وينبغي تعديلها حسب الحاجة. لمزيد من التفاصيل ، انظر 5.
- سحب حقن عدة pipets (2-5) في طبق من الخلايا العصبية ليتم حقنه في حالة وقوع أضرار أو مشاكل أثناء الدورة الحقن. pipets حقن تخزينها في وعاء مغطى لمنع الغبار من دخول طرف الماصة microinjection.
II. Intranuclear microinjection
خيمة "> هذا القسم تفاصيل عملية الحقن [كدنا] في نواة الخلايا العصبية. microinjection الأساسية لانشاء يتضمن مقلوب على النقيض من المرحلة المجهر (مثل نيكون Diaphot TMD ، نيكون ، ميلفيل ، نيويورك) لتصور العملية ، micromanipulator (على سبيل المثال إيبندورف 5171) للسيطرة على حركة الماصة الحقن وحاقن ضغط (على سبيل المثال إيبندورف FemtoJet اكسبريس) لطرد حل [كدنا] من الماصة. توصيل حاقن الضغط على micromanipulator يسمح للتزامن العمليات الأخيرين خلال الحقن. أخرى اختياري ، ولكن يوصى بشدة ، ومكونات تشمل نظام مراقبة فيديو محمولة (CCD الكاميرا ، Cohu ، وشركة سان دييغو ، كاليفورنيا ، أبيض وأسود شاشة فيديو ، سوني كوربوريشن ، طوكيو ، اليابان) ، وهذا النظام ليس شرطا مطلقا للحقن ؛ ومع ذلك ، فإن رصد بالأبيض والأسود تقدم التباين العالي لرؤية تحسن في نواة الخلية ، ويوفر تجربة مشاهدة أكثر راحة خلال جلسات الحقن طويلة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام جهاز كمبيوتر محمول لتشغيل برنامج تشغيل وحدة تحكم باليد إلى شبه أتمتة عملية الحقن (انظر مناقشة للتفاصيل).الوقت المثالي لحقن الخلايا العصبية SCG هو 3-6 ساعات ما بعد التفكك. في هذه المرحلة ، كانت الخلايا كروية ، المرفقة بإحكام على الجزء السفلي من الطبق ، ونواة واضحة تماما ، تحت المجهر المرحلة على النقيض ، بوصفها عضية الدور المركزي مع غشاء الظلام ، ويحتوي على واحد أو عدة نويات (الشكل 1A).
- وضع طبق من الخلايا العصبية نأت على مركز للمرحلة المجهر. ضبط التركيز وتحسين البصريات المقابل مرحلة من مراحل المجهر حتى نوى الخلايا العصبية واضحة للعيان.
- الماصة 2 ميكرولتر من حل [كدنا] أعدت إلى الماصة microinjection باستخدام طرف الماصة microloader. تجنب وضع حل بالقرب من أسفل الأنبوب الهيماتوكريت لأن هذا قد يثير الجسيمات التي استقرت خلال الطرد المركزي. ينبغي للخيوط في pipets microinjection المعونة في رسم حل للطرف ، ولكن إذا فقاعات هواء صغيرة لا تزال قائمة ، ونفض الغبار بلطف الجانب من الزجاج لإخراجهم.
- إدراج الماصة microinjection في ماسك شعري من حاقن الضغط ثم تأمين لحامل micromanipulator. هو ثابت صاحب بزاوية 45 درجة.
- انخفاض الماصة microinjection في الطبق. كما الماصة يدخل المتوسطة والثقافة ، ويتم تشكيل هلالة الذي يؤثر على انكسار الضوء ويقلل من جودة الصورة من الخلايا العصبية. للتخفيف من حدة هذه المشكلة ، يمكن البرج الدائري المرحلة يعوض قليلا حتى نوى الخلايا العصبية تكون مرئية بوضوح مرة أخرى.
- بعض أنظمة حقن الضغط لديهم "نظيفة" وظيفة التي تنطبق أقصى ضغط الهواء من طرف microinjection الماصة لمدة قصيرة. استخدام هذه الدالة لمسح الماصة من الحطام قبل البدء وأثناء الحقن إذا انسداد يظهر التلميح. إذا كان السائل بدد غير مرئية على الشاشة أثناء استخدام هذه الوظيفة ، مع استبدال الماصة حقن جديدة.
- مركز الماصة microinjection في عرض ورصد محاذاة الطرف بجوار الخلايا العصبية في الطائرة والتنسيق نفس نوية. تعيين هذا الموقف باعتباره الحد الأدنى ض محور على micromanipulator. هذا الموقف هو عمق الماصة microinjection سيتقدم بها خلال الحقن. الموقف الآن ما يقرب من 30 ميكرومتر غيض فوق هذه النقطة حتى الماصة microinjection مسح الجزء العلوي من الخلايا العصبية.
- يمكن تعريف "حقن" واسطة لmicromanipulator 5171 إيبندورف مع الإعدادات التالية لإجراء الحقن intranuclear. يتم تعيين الدالة على حقن ، بينما يتم ترك الوظيفة أسعد قبالة. مسار حقن قطري (طول X - Z والمحور) وتنتج كمية أقل من تلف الخلايا ، وبالتالي يجب استخدام النمط المحوري للحقن. سرعة الحقن من 300 ميكرون / ثانية غير كافية ، وتزامن تراكم الضغط عندما يصل الماصة microinjection مجموعة ض محور الحد.
- حاقن الضغط تسيطر على كمية من محلول يحقن [كدنا] النواة. في "تلقائي" واسطة الحقن ، وإيصال الحمض النووي هو الوقت التي تسيطر عليها والتي بدأها micromanipulator متصلة. يجب تعيين ضغط الحقن (بي) بين 100 و 200 hectopascals (هكتوبسكال (1) ؛ هكتوبسكال ~ 0.015 رطل) ، والضغوط العالي الحقن لا تحسين معدلات النجاح أو نوعية الحقن ، وربما يشير إلى مشاكل أخرى مع طرف حجم microinjection الماصة أو الحمض النووي النقاء . لمدة الحقن (TI) من 0.3 ليالي وضغط التعويض (PC) المؤرخ 30 HPA ، التي تمد الضغط المستمر إيجابية لتجنب دخول الإطباق على جزيئات من مستنبت في تلميح الماصة ، ينبغي استخدامها.
- موقف الخلايا العصبية ليتم حقنه تحت غيض من الماصة microinjection التحكم باستخدام المجهر في مرحلة س ص المحور. محاذاة غيض من الماصة فوق مركز النواة من خلال التركيز ذهابا وإيابا بين طنإنه غيض من ونويات.
- حقن نواة عن طريق الضغط على زر حقن (في micromanipulator). للخطوة الحقن ، ويتم التحكم في حركة الماصة microinjection والإفراج عن حل [كدنا] من micromanipulator. فمن الصعب تأكيد الحقن intranuclear الناجحة التي قام بها العين ، ولكن حقن محلول اللزوجة المنخفضة نسبيا [كدنا] (مقارنة للبيئة لزجة النووية) ، ويبدو في كثير من الأحيان سحابة بيضاء في إطار المرحلة على النقيض من البصريات ، ويمكن استخدامها كمؤشر للحقن في النواة. أحيانا لا الماصة microinjection اختراق الغشاء النووي والوكزات ببساطة النواة. قد يكون محاولة حقن الثانية في نفس الموقف يؤدي إلى حقن ناجحة من الحمض النووي في نواة. تورم الخلية يدل عادة الحقن هيولي غير مقصود. أيضا ، لا يتم التسامح مع تورم نووية هامة بشكل جيد من قبل الخلايا العصبية ويؤدي عادة الى موت الخلايا بعد ذلك بوقت قصير ، وبالتالي فإن ضغط الحقن ومدة يجب ألا تتجاوز القيم المقترحة.
- تواصل ضخ الخلايا العصبية التي تموضع المرحلة المجهر لمحاذاة الخلايا العصبية القادم تحت الماصة microinjection. انتقل بشكل منهجي من خلال ضخ ما يقرب من صحن 5-10 نوى قبل عودته طبق من الخلايا العصبية إلى حاضنة لتفريخ بين عشية وضحاها. يمكن التعرف على الخلايا العصبية بنجاح حقن في اليوم التالي التعبير عن الجينات المراسل.
III. ممثل النتائج
الشكل 1 : عقدة عنق الرحم فخمة (SCG) الخلايا العصبية.
صورة المرحلة النقيض من الخلايا العصبية SCG 3 ساعات ما بعد التفكك (A). في هذه المرحلة ، هي نواة واضحة للعيان الذي يساعد محاذاة microinjection طرف الماصة. النواة يظهر في وسط من الخلايا العصبية مع نويات (يمين) واحد (يسار) أو متعددة الظلام.
SCG الخلايا العصبية بعد 16 ساعة من الحقن EGFP [كدنا] في النواة (B). اليسار ، SCG الخلايا العصبية شوهدت في إطار المرحلة على النقيض من الإضاءة. الحق ، الصورة epifluorescent من الخلايا العصبية ذاتها تظهر الحقن الناجحة والناتجة التعبير EGFP في إحدى الخلايا العصبية.
شريط أبيض النطاق هو 20 ميكرومتر.
الشكل 2 : خلية كاملة من خلال تسجيلات لتيارات heterologously - G - أعرب البروتين يقترن تصحيح باطنه K + (GIRK) SCG القنوات من الخلايا العصبية.
وقد أثار GIRK التيارات (I GIRK) بواسطة منحدر الجهد 200 مللي من -140 إلى +40 بالسيارات من المحتمل عقد -60 بالسيارات (أقحم من ألف) التنشيط التالية الذاتية α adrenoceptors - 2 بواسطة بافراز (شمال شرق ، 10 ميكرومتر) . واثار فرضه تسجيلات من الخلايا العصبية نفسها ، وتبين من قبل (السوداء) وبعد تطبيق إما وحدها الأدنى (الأزرق) أو NE زائد 10 ملم با 2 + (الحمراء). خطوط متقطعة تشير إلى مستوى الصفر الحالية.
لتسجيل GIRK أنا ، والحل الخارجي الوارد (مم) 130 كلوريد الصوديوم و 5.4 بوكل ، 10 HEPES ، 10 CaCl 2 ، 0.8 MgCl 2 ، 15 الجلوكوز والسكروز 15 ، وTTX 0.0003 ، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم. الحل تسجيل الداخلية الواردة (مم) 135 بوكل ، 11 EGTA ، 1 CaCl 2 ، 2 MgCl 2 ، 10 HEPES ، 4 MgATP ، و 0.3 نا 2 GTP ، بعد تعديلها لدرجة الحموضة 7.2 مع KOH.
عدم وجود الحالية التي تسببها المنحدر الجهد في وجود الخلايا العصبية في شمال شرق SCG uninjected (A) يدل على أن الخلايا العصبية SCG لا تعبر عن GIRK القنوات المحلية. حقن بنجاح ترميز [كدنا] البلازميد وظيفية GIRK قناة 11 يثير تيارات كبيرة خلال منحدر الجهد عند تعرضها للNE (B ، يسار). التيارات والخصائص النموذجية التيارات من خلال القنوات GIRK : التنشيط بواسطة ناهض G - مستقبلات البروتين يقترن (شمال شرق) ، وتصحيح الداخل ، وكتلة من التيارات التي كتبها مانع GIRK القناة المفترضة ، با 2 + (B ، تتبع أحمر اليمين). دوائر مفتوحة ومليئة أنا GIRK تمثل في عقد القمة والحالية ، على التوالي. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.
المناقشة
واجه المشاكل المشتركة والاقتراحات :
كما ذكر ، في وقت سابق حقن النووية الناجحة تعتمد على وجود خلايا لوحات ملتصقة زراعة الأنسجة. تأجيل بدء حقن بضع ساعات بعد إجراء تفارق الخلايا العصبية يسمح للانضمام إلى أسفل من الأطباق. بالإضافة إلى ذلك ، الأطباق طلاء بنسبة 0.1 ملغ / مل من الوزن الجزيئي عالية بولي - L - يسين (سيغما ، وسانت لويس ، MO) الإيدز التصاق الخلايا العصبية على السطح السفلي من الأطباق.
يمكن انسداد pipets microinjection ، وخصوصا عندما تحاول حقن تركيز عالية من الحمض النووي ، ومشكلة متكررة. يمكن استخدام أعمدة عالية الجودة لفصل وتنقية عزل DNA البلازميد ، وتنفيذ الخطوات الإضافية المذكورة تنقية (فلاتر تدور ، والغزل في أنابيب الهيماتوكريت) يساعد على إزالة الجسيمات قبل عن طريق الحقن. خلال الحقن ، ويمكن استخدام "نظيف" وظيفة من حاقن الضغط (ليالي 0.2 كافية) ، ولكن إذا كان هذا لا يحل المشكلة ، يجب استخدام الماصة حقن جديدة. إذا كانت غالبية pipets microinjection انسداد أثناء جلسة الحقن ، والنظر في تغيير إعدادات الزجاج مجتذب الماصة لإنتاج نصائح الماصة microinjection مع افتتاح أكبر.
والمشكلة الأخرى التي تنشأ خلال الحقن النووية هو التفاوت من السطح السفلي من الأطباق زراعة الأنسجة. هذا التغير يؤثر بشكل مباشر على دقة استهداف نصائح الماصة للحقن نواة منذ عمق ثابت يخترق الماصة خلال الحقن. لذا ، لا بد من تعديل هذا الحد ض محور أثناء الحقن داخل الطبق نفسه. وسوف يكون واضحا عند إجراء تعديل ضروري : لن يكون هناك أي مؤشر على حقن النووي (أي سحابة بيضاء في نواة أو غاب كليا الخلية) ، أو طرف الماصة حقن يقترب من قاع الطبق (ضغط الخلية تحطمها أو حتى التلميح الماصة في قاع الطبق). ويمكن استخدام الزجاج استنساخ الاسطوانات (OD 10 ملم ، القط رقم 2090-01010 ، Bellco زجاج Vineland ، ونيو جيرسي.) خلال طلاء الخلايا العصبية لحصرها في منطقة أصغر حجما وأكثر محصورة ؛ بالتالي تقليل المسافة المطلوبة للتحرك والماصة بين الحقن الحقن. تتم إزالة هذه الاسطوانات الاستنساخ قبل تنفيذ microinjections.
عيوب التقنية :
microinjections Intranuclear يطالبون تقنيا ، والتي تتطلب الصبر وعلى درجة عالية من البراعة اليدوية من قبل المشغل. الكفاءة مع هذه التقنية ، كما هو الحال مع أي مهارة أخرى ، ويأتي مع الممارسة. وهكذا ، ينصح لممارسة حقنا النووي من الجينات وحدها قبل محاولة مراسل التجارب الفعلية. لمزيد من المساعدة في عملية الحقن ، قد يكون من الممكن لترسيخ خطوات micromanipulator حاقن والضغط في برنامج الكمبيوتر. ويمكن استخدام برامج مثل ايغور برو (WaveMetrics ، بحيرة أوسويجو ، OR) لتخزين الإعدادات microinjection وبرنامج التحكم متعددة الوظائف (ShuttlePro ، كونتور تصميم ، ويندهام ، NH) إلى شبه أتمتة عملية الحقن (انظر ل6،7،8 مزيد من التفاصيل).
عيب آخر من تقنية microinjection intranuclear هي نسبة النجاح منخفضة. حوالي 10-20 ٪ من عمليات الحقن النووية حاول التعبير تؤدي إلى البروتين. هذه الكفاءة في حين قد تكون كافية للتطبيقات التي لا تحتاج إلى عدد كبير من الخلايا بالإعراب ، الكهربية على سبيل المثال ، لفحوصات البيوكيميائية المختلفة هذا قد لا يكون كافيا.
تطبيقات التقنية :
على الرغم من عيوبه ، microinjection intranuclear من الحمض النووي هو تقنية مفيدة للغاية للتعبير عن heterologously البروتينات في الخلايا العصبية.
وحققت مستويات عالية من بروتين تعبير مع microinjections النووية نظرا لوجود عدد كبير من البلازميدات تطلق في نواة خلال الحقن ، داعية نشطة للغاية CMV تنظيم النسخ الجيني ، والاستقرار طويل من البلازميدات في النواة. أكثر من التعبير عن بروتين مفيد خصوصا في التجارب السلبية السائدة التي تتطلب مستويات عالية من البروتينات مغاير لتطغى على البروتين الذاتية. ميزة أخرى لحقن intranuclear هو القدرة على تحقيق نسبة ثابت من ثوابت [كدنا] إلى النواة عندما يتم حقن بنيات متعددة. مع أساليب أخرى ترنسفكأيشن ، فمن الصعب أن أعرض بتكاثر نفس النسبة من كل بناء الحمض النووي في خلايا مختلفة في نفس الطبق وبين transfections. الحقن المباشر للحل [كدنا] في نواة يلغي هذا المصدر من مصادر التباين ويسمح titered نسبة من البروتينات وأعرب على نحو فعال.
الأساليب التقليدية ترنسفكأيشن تكون ذات فعالية محدودة في مرحلة ما بعد الإنقسامية الخلايا لأن التأسيس منخفضة من الحمض النووي في نواة (9) وسمية المواد الكيميائية المرتبطة reag ترنسفكأيشنالوالدان 10. microinjections النووية في التغلب على هذه القضايا من خلال إدخال المادة الوراثية في نواة ميكانيكيا. على الرغم من أن هذا الأسلوب هو أكثر انخراطا ، والقدرة على دراسة تأثير وجود البروتين في النظام البيولوجي الوظيفي ، مع استكمال الذاتية مسارات إشارة ، فإن أكثر من يعوض عن طبيعة شاقة من هذه التقنية.
تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات وفقا للمعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان والاستخدام.
شكر وتقدير
ويدعم أبحاثنا المختبر من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة ، المعهد الوطني لتعاطي الكحول والإدمان على الكحول.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| وحدة ترشيح Ultrafree-MC | EMD Millipore | UFC30VV00 | مرشح Durapore PVDF؛ حجم مسام 0.1 μm |
| محلول TE المنظم | Quality Biological, Inc. | 351-010-131 | 10 mM Tris، 1 mM EDTA، pH 8.0 |
| أنابيب شعرية لقياس الهيماتوكريت الدقيق | Fisher Scientific | 22-362-574 | التحضير غير المعالج بالهيبارين: تُنقع في إيثانول 100% طوال الليل. تُغسل جيداً بالماء منزع الأيونات ثلاث مرات ويُجفف الزجاج في فرن (95°C). تُقطع أنابيب الهيماتوكريت المنظفة إلى قطع بطول 3-4 cm باستخدام أداة تخطيط ذات رأس ماسي، ويُغلق أحد الطرفين باللهب باستخدام ملقط للإمساك بالزجاج. تُحفظ في دورق زجاجي نظيف وتُغطى لمنع تراكم الغبار. |
| جهاز طرد مركزي دقيق | Eppendorf | 5417 R | مع دوار ثابت الزاوية أو دوار ذو سلال متأرجحة |
| رؤوس ماصات Microloader 20 μl | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| زجاج شعري للحقن الدقيق | World Precision Instruments, Inc. | TW120F-4 | جدار رقيق مع فتيلة، القطر الخارجي 1.2 mm، القطر الداخلي 0.9 mm، الطول 100 mm |
| جهاز سحب الماصات الدقيقة (Flaming/Brown Micropipette Puller) | Sutter Instrument Co. | P-97 | مع فتيلة صندوقية من البلاتين والإريديوم (قطعة رقم FB330B) |
| مجهر Nikon Diaphot TMD المقلوب | Nikon Instruments | عدسات شيئية بتباين طوري 20x و 40x، مثبتة على طاولة عزل للاهتزازات | |
| كاميرا ذات جهاز اقتران شحني (CCD) | Cohu Inc. | 6410 | |
| شاشة فيديو | Sony Corporation | PVM-122 | باللونين الأبيض والأسود، شاشة 9” |
| نظام التحكم الدقيق (Micromanipulator system) | Eppendorf | 5171 | |
| وحدة الحقن الدقيق | Eppendorf | FemtoJet Express | |
| جهاز التحكم في الحقن الدقيق | Contour Design | S-PROV2 | جهاز تحكم وسائط متعددة قابل للبرمجة |
| Igor Pro | WaveMetrics | Version 4.05A | برنامج أوامر للتحكم في جهاز التحكم في الحقن الدقيق من كتابة S. Ikeda |
المراجع
- Eccles, J. C. The action potential of the superior cervical ganglion. J Physiol. 85, 179-206 (1935).
- Ikeda, S. R. Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein βγ subunits. Nature. 380, 255-258 (1996).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Brain Res. 485, 205-214 (1989).
- Schofield, G. G., Ikeda, S. R. Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons. Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).
- Dean, D. A. Chapter 4. Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. Goldman, R. D., Spector, D. L. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 51-66 (2005).
- Ikeda, S. R. Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).
- Ikeda, S. R. Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection. Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).
- Ikeda, S. R., Jeong, S. W. Use of RGS-insensitive Gα subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons. Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).
- Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30, 606-610 (2008).
- Vivaudou, M. Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants. J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).
إعادة الطباعة والأذونات
