تم تطبيق الليزر لتحليل الجينات microdissection التنميط التعبير في مقصورات معينة من القرص جناح ذبابة الفاكهة تتعرض لرني المترجمة في الجسم الحي. وقد تم تحليل الحمض النووي الريبي المستخرج من مناطق يعادل المقصورات وإسكات unsilenced بواسطة RT - PCR الكمي لتحديد ملامح التعبير الجيني المقارن في سياق microecology الأنسجة الأصلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التطبيقية ليزر Microdissection التنميط التعبير الجيني للخلايا من المجموعة الثانوية من ذبابة الفاكهة جناح القرص
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد ثبت الطبيعة غير المتجانسة للأنسجة ليكون عاملا يحد من كمية المعلومات التي يمكن توليدها من العينات البيولوجية ، وتحليلات المساس المصب. النظر في الجمعيات المعقدة والديناميكية الخلوية الموجودة داخل العديد من الأنسجة ، من أجل أن ألخص في التفاعلات الجزيئية فيفو تحليل دقيق يجب على المرء أن يكون قادرا على تحليل السكان خلية معينة ضمن سياقها الأصلي. ويمكن بوساطة الليزر microdissection تحقيق هذا الهدف ، مما يسمح تحديد لا لبس فيها والحصاد الناجح للخلايا من الفائدة في ظل التصور المجهري المباشر مع المحافظة على سلامة الجزيئية. لقد طبقنا هذه التكنولوجيا لتحليل الجينات داخل مناطق محددة من القرص النامية جناح ذبابة الفاكهة ، وهو ما يمثل نظام نموذجي لدراسة المفيد مراقبة النمو ، وتمايز الخلايا وorganogenesis. وتنقسم precociously أقراص تخيلي اليرقات داخل المقصورات الأمامية والخلفية ، والظهري البطني بواسطة تقييد حدود النسب. الاستفادة من محرض GAL4 - UAS نظام ثنائي التعبير ، ويمكن لكل من هذه المقصورات المسمى تحديدا في الذباب المعدلة وراثيا إبداء التحوير UAS - GFP تحت سيطرة المناسبة GAL4 سائق بناء. في الأقراص المعدلة وراثيا ، ويمكن على وجه التحديد التنميط الجيني التعبير عن مجموعات فرعية منفصلة من الخلايا يتحدد بعد بوساطة الليزر microdissection ، وذلك باستخدام إشارة GFP الفلورسنت لتوجيه الليزر قطع.
من بين مجموعة متنوعة من التطبيقات المصب ، وركزنا على التنميط النص بعد تدخل الحمض النووي الريبي RNA مترجم (رني). مع ظهور التكنولوجيا رني ، يمكن أن يترافق مع وضع العلامات GFP ضربة قاضية المترجمة من جين معين ، مما يسمح للاستجابة الترانسكربتي الحاسم للسكان الخلية المنفصلة إلى إسكات جينات معينة. للتحقق من صحة هذا النهج ، ونحن تشريح المناطق يعادل القرص من الخلفي (المسمى من قبل التعبير GFP) ، والأمامي (لا تحمل علامات) مقصورة على إسكات الإقليمية في المقصورة ف من الجينات على خلاف ذلك أعرب بتواجد مطلق تم استخراج الحمض النووي الريبي من microdissected المناطق أسكت وunsilenced والمقارنة التنميط التعبير الجيني التي تحددها الكمية في الوقت الحقيقي RT - PCR. يمكن أن نظهر هذه الطريقة فعالة لتطبيقها transcriptomics دقيقة من مجموعات فرعية من الخلايا داخل أقراص تخيلي ذبابة الفاكهة. في الواقع ، في حين ضخمة إعداد القرص كمصدر من الحمض النووي الريبي يفترض عموما التجانس الخلية ، فمن المعروف جيدا أن التعبير يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا الترانسكربتي داخل هذه الهياكل في ذلك المعلومات الموضعية. باستخدام مترجم إشارة GFP الفلورسنت لتوجيه الليزر قطع ، يمكن إجراء تحليلات أكثر دقة والترانسكربتي تطبيق مربح لتطبيقات متباينة ، بما في ذلك التنميط نص الأنساب خلية مستقلة ضمن سياقها الأصلي.
البروتوكول
الجزء 1. إعداد أقراص جناح ذبابة الفاكهة خضعت لتخيلي رني محددة والمترجمة.
والمواد البيولوجية ، استخدمنا أقراص الجناح تخيلي ذبابة الفاكهة التي تم الحصول عليها من يرقات وراثيا تخضع لإسكات جينات معينة والمترجمة عن طريق نظام GAL4/UAS 1. هذا النسل اليرقات orginates من كرة عرضية الوراثية التي تنطوي على خطين الوالدين : واحد يحمل السائق GAL4 ، والثانية في الرد UAS. بالإضافة إلى التعبير عن GAL4 في نمط زمنية محددة و / أو المكاني ، والخط سائق يحمل مراسل UAS - GFP التي تسمح لتصور المجال GAL4 التعبير. سطر المستجيب UAS يعرب تحت سيطرة تسلسل UAS ، وه....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
فيما يتعلق مستوياتها التعبير القاعدية التي تحققت في المقصورات الأمامية / الخلفية من أقراص الجناح unsilenced ، تم العثور على نشاط الجين المحدد X خفضت الى 40 ٪ عند إسكات. في المقابل ، تم العثور على واحد من أهدافها المفترضة (الجينات Y) بشكل ملحوظ التنظيم (7 أضعاف الزيادة) ، مما يؤدي بنا للتحقق من صحة الفرضية التي تم تنظيمها من قبل سلبا عاشرا الجين
يمكن أن نستنتج أن هذا النهج بنجاح المذكورة أعلاه تجريبية يتم تطبيقها .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
شكر وتقدير
الكتاب نشكر الاستاذ. كيارا كامبانيلا وعمرة مركز الاختصاص ، جامعة نابولي فيدريكو الثاني ، نابولي ، ايطاليا ، لتزويدهم استخدام microdissector الليزر ، والسيد فينتشنزو Vicidomini للحصول على مساعدة سخية في الرسوم المتحركة 3D.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
سلالات ذبابة
ويمكن الحصول على ذبابة الفاكهة UAS - إسكات من خطوط VDRC رني جمع 2. مجموعة من الخطوط سائق GAL4 يتوفر في مركز ألبوم ذبابة الفاكهة بلومينغتون (انديانا ، الولايات المتحدة).
معدات
وتشمل المعدات المطلوبة ليزر microdissector (لايكا LMD6000) ، 22R Microfuge كولتر (بيكمان) ، PCR (BIO - RAD Cycler بلدي) ، ريال مدريد PCR الوقت (BIO - RAD iQ5).
أدوات
الأدوات المطلوبة وتشمل : زجاج الآبار ، والفرشاة ، وملقط microdissection ، والشرائح قطرة شنقا ، ودبابيس الحشرات التي شنت على إبر المحاقن ، والإطارات المعدنية مع غشاء الدائرة ، وأنابيب بلاستيكية (50 مل ، 05 مل ، 0.25 مل).
المراجع
- Elliott, D. A., Brand, A. H. The GAL4 System A Versatile System for the Expression of Gene. Dahmann, C. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2008).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Current Opinion in Genetics & Development. 11, 470-475 (2001).
- Dietzl, G.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
