وقد تحقق تلطيخ تعليق immunocytochemical البشرية الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) عن سطح الخلية علامات (SSEA-3/SSEA-4) على أساس استخدام جهاز cytospin عصامي لإنشاء أحادي الطبقة من الخلايا للمراقبة والقياس الكمي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Immunocytochemical تحليل الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة باستخدام جهاز Cytospin عصامي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hPSCs) التي تشمل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والبشرية الناجمة عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs) هي مصادر الخلية مثيرة نظرا لقدراتها الذاتية التجديد لا حدود لها وقدرتها على التمايز إلى أنواع خلايا متعددة. عادة ما يتم تقييم حالة المحفزة للhPSCs بواسطة تقنيات مثل qPCR ، كيمياء سيتولوجية مناعية ، وغيرها
البروتوكول
الجزء 1 : يلطخ تعليق Immunocytochemical
- ويتم حصاد الخلايا في خلية واحدة تعليق.
- ثم يتم نقل الخلايا في أنابيب microcentrifuge 1.5 2mL وطرد في 200G لمدة 4 دقائق.
- تغسل الخلايا التي طاف بها الشفط ، وإعادة معلقة في 1mL من برنامج تلفزيوني -- (بدون المغنيسيوم والكالسيوم 2 + 2 +) ثم طرد مرة أخرى في 200G لمدة 4 دقائق. وينبغي أن يتم ذلك مرتين.
- بعد غسلها ، ثم يتم إصلاح الخلايا عن طريق إعادة تعليقها في بارافورمالدهيد ٪ 1mL من 4 (PFA) في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- يتم غسلها مرتين مع الخلايا مرة أخرى 1mL من برنامج تلفزيوني --
- بعد غسل كتلة الخلايا ، من خلال إعادة تعليقها في 1mL من الحل بلوك (6 ٪ serum/94 PBS ٪ --). احتضان هذه في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
- بعد ذلك ، في أنابيب الطرد المركزي 200G لمدة 4 دقائق ، ونضح من الحل بلوك. اعادة تعليق الخلايا في 1mL الضد من الحل الأساسي (كتلة مصنوعة من الحل في التخفيف مستحسن). يمكن أن تكون إما خلايا حضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة أو على 4 درجات مئوية خلال الليل قبل الشروع في الخطوة التالية.
- ثم يتم غسلها مرتين مع الخلايا 1mL من الحل بلوك.
- بعد ذلك اعادة تعليق الخلايا في جسم 1mL حل الثانوية (مصنوعة من كتلة الحل في التخفيف الموصى بها) ، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
- بعد 1 ساعة ، يجب أن تكون الخلايا ثم غسلها مرة أخرى مرتين مع 1mL من الحل بلوك.
- بعد غسله بمحلول بلوك ، يغسل خلايا مرة أخرى مع 1mL من برنامج تلفزيوني --
- بعد يغسل المختلفة ، وإعادة تعليق من الخلايا في 1mL دابي النووية وصمة عار (1:10،000 تخفيف دابي في برنامج تلفزيوني --) ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- بعد 5 دقائق ، في أنابيب الطرد المركزي 200G لمدة 4 دقائق. نضح بها النووية دابي حل صمة عار والخلايا في اعادة تعليق 1mL من برنامج تلفزيوني --
الجزء 2 : إدراج hPSCs في الشرائح التي تتولد من خلال جهاز cytospin
- وتعد الشرائح البلاستيكية بجعل المبلغ المطلوب من الثقوب فيها مع الصحافة الحفر. القطر يجب أن يكون أكبر في معظم 1MM من أوسع قطرها غيض micropipette (ق) ليتم استخدامها.
- يتم قطع الورق لتصفية المعلمات الشريحة من البلاستيك مع المقص.
- ثم يتم إجراء ثقوب في ورقة الترشيح. ينبغي أن حجم الثقب (ق) أن تكون كبيرة بما يكفي التلميح micropipette (ق) يناسب سنججلي من خلال ذلك.
- بعد ذلك ، وضعت واحدة من الشرائح البلاستيكية أعدت على أعلى شريحة زجاجية وضعت في أسفل ورقة تصفية قطع (الشكل 1). يتم تأمين طبقات مع الشريط.
- ثم يتم وضع كحد أقصى 100μL (اعتمادا على الكثافة أحادي الطبقة المطلوب) لتعليق الخلية الملون من الجزء 1 الى الجزء العلوي من طرف micropipette (ق).
- إذا لزم الأمر ، يمكن أن وزن الجهاز مع حل الخلية ، وخلق توازن مضاد لوزن مماثل.
- ويمكن للجهاز cytospin ومكافحة ميزان ثم توضع في جهاز الطرد المركزي في سطح المكتب وطرد 200G لمدة 4 دقائق.
- بعد الطرد المركزي ، يتم تفكيكها بعناية جهاز cytospin بطريقة أن لا إزاحة الخلايا من شريحة زجاجية.
- إذا ، من الضروري زيادة PBS المحيطة بها -- على الجانب الزجاجي في يستنشق بها.
- ويمكن عندئذ أن ينظر الخلايا باستخدام مجهر مضان للتحقق مما إذا تم تحقيق المونولاير الخلية المطلوبة.
الجزء 3 : تركيب الشرائح
- يتم وضع قطرة من وسائل الإعلام المطلوب تركيب مباشرة في مركز كل منطقة تحتوي على الخلايا.
- بعد ذلك يتم خفض بلطف زلة تغطية على الشرائح في محاولة لتجنب فقاعات الهواء إذا أمكن ذلك.
- ثم تتم إزالة الزائدة وسائل الاعلام متزايدة من الشرائح.
- بعد ذلك يتم اغلاق الجانبين من زلات مع تغطية طلاء الأظافر.
- يمكن الاحتفاظ الشرائح في منطقة مظلمة حتى يتم تخزين النتائج لوحظ وتوثيقها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لأغراض مختبرنا ، يتم تخصيص طبق 35mm الثقافات الخلايا الجذعية الجنينية المزروعة في الخلايا الليفية الماوس (MEFs) لإجراء تلطيخ immunocytochemical للاستخدام مع جهاز cytospin. ثم يتم جمع الخلايا من خلال الركض الأنزيمية ، وإزالة أكبر قدر من طبقة MEF ممكن ، في تعليق وحيد الخلية. إذا كان المطلوب أكثر من الخلايا الجذعية فعالة بمعزل عن طبقة MEF ، يمكن المستعمرات التقطت يدويا ثم هضمها في التعليق. إذا استخدمت ظروف التغذية الحرة في زراعة الخلايا الجذعية الثقافات ، يمكن ببساطة أن المستعمرات كش...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم توفير التمويل الجزئي لهذا العمل من قبل قوات الامن الوطني وظائف 0744556 (راو) وعلى منحة دراسية من خلال تعليم العلوم ، جامعة فرجينيا كومنولث HHMI وبرنامج البحث (باسكوال).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شرائح غرف Lab Tek Permanox | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 117437 | مادة للشرائح البلاستيكية المعاد استخدامها |
| شرائح مجهر Superfrost/Plus منظفة مسبقاً | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| رؤوس مرشحة 0.1-10μL | USA Scientific, Inc. | 1121-3810 | |
| غطاء زجاجي للمجهر | Fisher Scientific | 120542-B | |
| Cytoseal 280 | Richard-Allan Scientific | 8311-4 | وسط تثبيت |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| مصل ماعز طبيعي | Invitrogen | 10000C | |
| جسم مضاد أحادي النسيلة Mouse Anti-SSEA-4 | EMD Millipore | MAB4304 | جسم مضاد أولي لصبغ SSEA-4 |
| جسم مضاد أحادي النسيلة Rat Anti-SSEA-3 | EMD Millipore | MAB4303 | جسم مضاد أولي لصبغ SSEA-3 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11029 | جسم مضاد ثانوي لصبغ SSEA-4 |
| Alexa Fluor 488 Labeled Goat Anti-Rat IgG | Invitrogen | A11006 | جسم مضاد ثانوي لصبغ SSEA-3 |
| DAPI, Dihydrochloride | Calbiochem | 268298 |
المراجع
- Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. Cell surface markers in human embryonic stem cells. Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).
- Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. A homemade cytospin apparatus. Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
