استخراج الحمض النووي من الميكروبات غوت من النمل الأبيض (Zootermopsis Angusticollis) وتصور الميكروبات غوت

ملخص الإجرائية لاستخراج الحمض النووي النمل الأبيض كامل الأمعاء :

1. النمل الأبيض البرد على الجليد ، وإزالة الأمعاء باستخدام ملاقط معقمة والاستقرار في عينات الأمعاء العازلة.
2. التجانس في عينات PVPP / SDS / العازلة الفينول.
3. استخراج وتنقية الحمض النووي من الخام باستخدام lysate Qiagen DNeasy الأعمدة.

البروتوكول :

1. على الجليد ، وإزالة الشجاعة من النمل العامل الطبقي باستخدام ملقط معقم.
2. نقل على الفور إلى الشجاعة ومحتويات أنبوب nuclease معقمة وخالية من الجليد يحتوي على 50 ميكرولتر الباردة 1X البيولوجيا الجزيئية الصف TE العازلة (1 ملم تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، EDTA 0.1 ملم ، ودرجة الحموضة 8.0). تجميد العينات في -20 درجة مئوية ، أو الانتقال مباشرة مع التجانس.
3. نقل العينات القناة الهضمية والعازلة لعقيمة ، nuclease خالية من 2 مل أنبوب المسمار توج محملة مسبقا مع 500 ملغ من الخرز الزركونيا / السيليكا العقيمة (0.1 ملم) و 700 ميكرولتر من TE 1X العازلة التي تحتوي على 1 ٪ ث / ت polyvinylpolypyrrolidone (PVPP ).
4. إضافة 50 ميكرولتر 20 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) و 500 ميكرولتر من الفينول للعينات.
5. التجانس (فاز حبة) على أعلى الإعداد باستخدام ثلاث دورات من التجانس ثوانى 30 و 30 ثانية من تقشعر لها الأبدان على الجليد.
6. مواد غير قابلة للذوبان الرواسب 1 دقيقة في لز س 8000.
7. تطهير 300 ميكرولتر aliquots طبقة (العلوي) مع الأعمدة المائية Qiagen DNeasy باستخدام الطريقة الموصوفة لتنقية lysate الخام.
8. تحديد محتوى حمض النووي وتجميد العينات في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.

In our experience, DNA extracted from the microbial communities of wood-feeding termite species like Zootermopis nevadensis is sufficiently pure for PCR template after one round of extraction and purification. However, some termites such as litter-feeding and soil-feeding species may have a higher concentration of humic acids in their gut contents and may require additional purification of gut microbial DNA. The total DNA yield from the guts of 5 Z. nevadensis workers is in the range of 10-30 μg. For termite species significantly smaller or larger than this species, more or fewer specimens may be needed to obtain a similar amount of DNA.

This method can easily be adapted to allow RNA extraction. For RNA extraction, substitute 1x RNAprotect Bacteria reagent from Qiagen (catlog no. 76506) for the ice-cold TE buffer described in step 2 of the protocol. Qiagen RNeasy reagents and columns (catlog no. 74104) should be used in place of the DNeasy purification procedure described above. As DNA can be purified from RNAprotect-stabilized samples and only 300 μL of the approx. 700 μL aqueous layer retrieved in step 7 is required for nucleic acid purification, this method can be used to retrieve both DNA and RNA in parallel from a single sample.

These techniques depend on the extraction and purification of high-quality nucleic acids from the termite gut environment. The extraction technique described in this video is a modified compilation of protocols developed for extraction and purification of nucleic acids from environmental samples (Moré et al., 1994; Berthelet et al., 1996; Purdy et al., 1996; Salmassi & Leadbetter, 2003; Ottesen et al. 2006) and it produces DNA from termite hindgut material suitable for use as template for polymerase chain reaction (PCR).