هذا الفيديو يوضح تقنية لاستخراج الحمض النووي من أنواع الميكروبات المقيمين في المعى المؤخر النمل الأبيض. ويتضح ايضا في اعداد شريحة جبل الرطب ، وهو أمر مفيد لتصور المجتمع الميكروبية الأمعاء ، ويعطى من خلال جولة الأنواع الغنية بيئة الأمعاء.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخراج الحمض النووي من الميكروبات غوت من النمل الأبيض (Zootermopsis Angusticollis) وتصور الميكروبات غوت
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
النمل الأبيض هي من بين عدد قليل من الحيوانات المعروفة لديهم القدرة على العيش فقط من الخشب طويلا. الجهاز يحتوي على أمعاء النمل الأبيض كثيفة السكان الميكروبية والأنواع الغنية التي تساعد في تدهور lignocellulose في الغالب إلى خلات والمغذيات الرئيسية تأجيج الأيض النمل الأبيض (Odelson وBreznak ، 1983). ضمن هؤلاء السكان هي البكتيريا الجرثومية ، وميثان العتيقة ، في بعض النمل الأبيض ("خفض") ، البروتوزوا حقيقية النواة. وهكذا ، النمل الأبيض وتخضع البحوث الممتازة لدراسة التفاعلات بين الأنواع الجرثومية والكيميائية الحيوية وظائف عديدة أنها تؤدي إلى منفعة المضيفة لهم. وقد تم اكتشاف تركيبة السكان الأنواع الميكروبية في أمعاء النمل الأبيض وكذلك الجينات الرئيسية المشاركة في العمليات الحيوية المختلفة وذلك باستخدام التقنيات الجزيئية (كودو وآخرون ، 1998 ؛. شميت ، واجنر وآخرون ، 2003 ؛. Salmassi ويدبيتر ، 2003). هذه التقنيات تعتمد على استخراج وتنقية عالية الجودة الأحماض النووية من البيئة أمعاء النمل الأبيض. تقنية استخراج وصفها في هذا الفيديو هو عبارة عن تجميع معدلة من البروتوكولات التي وضعت لاستخراج وتنقية الأحماض النووية من العينات البيئية (مور وآخرون ، 1994 ؛. Berthelet وآخرون ، 1996 ؛. بوردي وآخرون ، 1996 ؛. Salmassi ويدبيتر ، 2003 ؛ Ottesen وآخرون 2006) ، وأنها تنتج من مادة الحمض النووي المعى المؤخر النمل الأبيض مناسبة للاستخدام كقالب لتفاعل البلمرة المتسلسل (PCR).
البروتوكول
ملخص الإجرائية لاستخراج الحمض النووي النمل الأبيض كامل الأمعاء :
- النمل الأبيض البرد على الجليد ، وإزالة الأمعاء باستخدام ملاقط معقمة والاستقرار في عينات الأمعاء العازلة.
- التجانس في عينات PVPP / SDS / العازلة الفينول.
- استخراج وتنقية الحمض النووي من الخام باستخدام lysate Qiagen DNeasy الأعمدة.
البروتوكول :
- على الجليد ، وإزالة الشجاعة من النمل العامل الطبقي باستخدام ملقط معقم.
- نقل على الفور إلى الشجاعة ومحتويات أنبوب nuclease معقمة وخالية من الجليد يحتوي على 50 ميكرولتر الباردة 1X البيولوجيا الجزيئية الصف TE العازلة (1 ملم تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، EDTA 0.1 ملم ، ودرجة الحموضة 8.0). تجميد العينات في -20 درجة مئوية ، أو الانتقال مباشرة مع التجانس.
- نقل العينات القناة الهضمية والعازلة لعقيمة ، nuclease خالية من 2 مل أنبوب المسمار توج محملة مسبقا مع 500 ملغ من الخرز الزركونيا / السيليكا العقيمة (0.1 ملم) و 700 ميكرولتر من TE 1X العازلة التي تحتوي على 1 ٪ ث / ت polyvinylpolypyrrolidone (PVPP ).
- إضافة 50 ميكرولتر 20 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) و 500 ميكرولتر من الفينول للعينات.
- التجانس (فاز حبة) على أعلى الإعداد باستخدام ثلاث دورات من التجانس ثوانى 30 و 30 ثانية من تقشعر لها الأبدان على الجليد.
- مواد غير قابلة للذوبان الرواسب 1 دقيقة في لز س 8000.
- تطهير 300 ميكرولتر aliquots طبقة (العلوي) مع الأعمدة المائية Qiagen DNeasy باستخدام الطريقة الموصوفة لتنقية lysate الخام.
- تحديد محتوى حمض النووي وتجميد العينات في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في تجربتنا ، الحمض النووي المستخرج من المجتمعات الميكروبية أنواع النمل الأبيض الخشب الثديية مثل nevadensis Zootermopis نقية بما فيه الكفاية لقالب PCR بعد جولة واحدة من استخراج وتنقية. ومع ذلك ، قد يكون بعض النمل الأبيض مثل التغذية وأنواع التربة القمامة الثديية لها تركيز أعلى من الأحماض الدبالية في محتويات حدسهم وتتطلب تنقية إضافية من الحمض النووي الميكروبية الأمعاء. الحمض النووي العائد الكلي من الشجاعة من 5 عمال nevadensis Z. هو في حدود 10-30 ميكروغرام. بالنسبة للأنواع النمل الأبيض أصغر بكثير أو أكبر ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| PVPP/SDS/phenol | منظم | منظم التجانس | ||
| DNeasy Tissue Kit | طقم استخلاص | Qiagen | 77607 | استخدم وفقاً لبروتوكول عزل DNA الجينومي من النواتج المحللة الخام (الملحق H، إصدار دليل المنتج: يوليو 2003) |
| TE | منظم | Sigma-Aldrich | T9285 | منظم 1x (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) مُعد من تركيز 100x |
| zirconia/silica beads | مستلزمات | Biospec Products | 11079101z | 0.1 mm |
| PVPP | كاشف | Sigma-Aldrich | P6755 | polyvinylpolypyrrolidone بتركيز 1% w/v مُعد من الكاشف الجاف كمعلق 1x في منظم TE |
| Zootermopsis nevadensis | حيوان | النمل الأبيض | ||
| SDS | كاشف | Sigma-Aldrich | L4390 | محلول Sodium dodecyl sulfate بتركيز 20% في الماء مُعد من الكاشف الجاف |
| Phenol | كاشف | Sigma-Aldrich | 77607 | مشبع بـ TE، ~73% |
| MiniBeadbeater-8 | أداة | Biospec Products | 963 | |
| BSS | محلول ملحي منظم، pH 7.2 | التركيبة لكل لتر: 2.5 g K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, و 10 mL من محلول 1 M من NaHCO3 | ||
| AxioPlan-2 | مجهر | Carl Zeiss, Inc. | مجهز بعدسة شيئية 40x، وعدسة optivar 1.6x وعدسات عينية 10x. فُحصت العينات باستخدام إضاءة تباين الطور |
المراجع
- Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns. FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).
- Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation. Extremophiles. 2, 155-161 (1998).
- Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment. Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).
- Odelson, D. A., Breznak, J. A. Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites. Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).
- Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria. Science. 314, 1464-1467 (2006).
- Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).
- Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis. Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).
- Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp). Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).
- Tsai, Y. L., Olson, B. H. Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
